Nature：寄生虫感染逞凶，小分子一箭三雕- 大数跨境

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2016-08-24

导读：诺华研究基金会基因组学研究所的Frantisek Supek等科学家，发现的化合物GNF6702，可以同时有效杀死三种寄生虫。

如今药物研发在飞速发展，然而在拉丁美洲、非洲、亚洲的贫困地区，不少人还饱受各种蚊虫叮咬带来的寄生虫感染折磨。环境污染恶化了传播链，而恶劣的生活和卫生条件又反过来加剧了环境污染，造成恶性循环。其中一些传染病直至目前也缺乏有效的治疗措施，如利什曼病（leishmaniasis）、恰加斯病（Chagas disease）和昏睡病（sleeping sickness），这三种疾病影响了约2千万人的生活，每年造成5万多人的死亡。

利什曼病

20多种利什曼虫属（Leishmania）的寄生虫均可导致利什曼病，人类感染源自被携带病原体的雌性双翅目白蛉叮咬，目前全世界约有3.1亿人口面临传染威胁，传播途径见图1。

图1. 利什曼病的传播模型。图片来源：CDC

利什曼病有三种主要形式：内脏利什曼病（visceral leishmaniasis，又名黑热病Kala-azar），2013年全球分布情况见图2，集中在拉丁美洲、非洲和亚洲；皮肤利什曼病（cutaneous leishmaniasis），在身体暴露部位主要引起溃疡等皮肤病变，会留有终生疤痕和严重残疾；粘膜皮肤利什曼病（mucocutaneous leishmaniasis），导致鼻子、口腔和喉咙粘膜部分或全部损毁。

图2. 2013年全球内脏利什曼病分布图。图片来源：WHO

恰加斯病

恰加斯病也称南美锥虫病（American trypanosomiasis），是寄生虫克氏锥虫Trypanosoma cruzi引起的一种可威胁生命的疾病。恰加斯病主要见于拉丁美洲，多数通过接触锥蝽臭虫（亦称吸血猎蝽）的粪便/尿液传播给人类。

图3. 锥蝽臭虫和克氏锥虫。图片来源：CDC

这些臭虫一般生活在建筑条件较差住房的墙壁或屋顶的缝隙中，它们通常在日间隐藏起来，到晚上就出来活动，叮人咬脸部等皮肤暴露区吸食血液，而且在叮咬处附近排便，当人把臭虫粪便/尿液抹到叮咬处、眼部、口腔或任何皮肤破损处时，寄生虫就进入人体。每年大约有800万人感染克氏锥虫，其中25%可能会导致慢性美洲锥虫病，导致心脏或肠道功能障碍。

昏睡病

昏睡病也称为非洲锥虫病（African trypanosomiasis），由寄生虫布氏锥虫Trypanosoma brucei 感染所致。这些寄生虫被携带病原体的采采蝇（舌蝇属）叮咬后传给人类。在第一阶段，锥虫在皮下组织、血液和淋巴中繁殖，会造成阵发性发热、头痛、关节疼痛和骚痒。在第二阶段，病如其名，寄生虫穿过血脑屏障感染中枢神经系统，导致行为改变、意识模糊、感觉障碍和动作协调性差。

图4. 采采蝇和布氏锥虫。图片来源：CDC

2014年世界卫生组织在4月7日世界卫生日的宣传口号是“小小叮咬危害大”（‘Small bite, big threat’），希望提高人们认识，如何保护自己免受蚊虫叮咬，避免感染它们可能传播的疾病。但一旦不幸被感染呢，总不能听天由命吧。

最近，诺华研究基金会基因组学研究所（GNF）的Frantisek Supek等科学家给人们带来了福音。通过高通量筛选、基因组学和结构修饰，一种新型的小分子化合物可以同时有效地杀死这三种寄生虫。

先导化合物与结构优化

三种疾病的元凶克氏锥虫Trypanosoma cruzi、利什曼原虫Leishmania和布氏锥虫Trypanosoma brucei具有相似的生物学特征。2005年科学家共同解密了这三种寄生虫的基因序列（Science, 2005, 309, 404-409, DOI: 10.1126/science.1112181），Science曾为此推出锥虫基因组的专刊，它们拥有类似的六千多个基因（图5），那就有可能通过一种药物调节某种共有的靶标以杀死这些寄生虫。

图5. 锥虫基因组比较。图片来源：Science

基于这种假设，Supek等人以半最大效应浓度EC₅₀ < 10 μM且哺乳动物细胞选择性大于5为要求，筛选了三百万个化合物，最终发现吡啶并噁唑类化合物GNF5343对克氏锥虫和布氏锥虫有效。但它抗利什曼原虫活性稍差，生物利用度小于5%。随后，他们以GNF5343为先导化合物进行结构优化，合成了约3000个化合物。采用经典的结构修饰方法，用C6-取代的咪唑环和三唑环代替原来的噁唑环，药效提高了20倍（GNF2636）。二甲基噁唑取代呋喃，能减少呋喃带来的毒性；氟化苯代替氯化苯，提高了对哺乳细胞生长抑制的选择性（GNF3849）。通过结构优化，提高了生物利用度，并且血浆清除率也令人满意。在C6位置上继续改造，最终得到了化合物GNF6702，它的抗利什曼原虫活性是先导化合物GNF5343的400倍。

图6. 先导化合物结构优化及活性比较。图片来源：Nature

小鼠模型活性测试

内脏利什曼病：被利什曼原虫感染的小鼠，每天喂养两次10mg/kg剂量的GNF6702后，肝脏里的原虫明显减少，与唯一的口服抗利什曼原虫临床物miltefosine米替福新（2014年获FDA批准）相比效果更好。

皮肤利什曼病：足部感染皮肤利什曼病（CL）的小鼠，接受每天两次的GNF6702，效果明显，如图7。

图7. 抗皮肤利什曼病效果。图片来源：Nature

恰加斯病：小鼠感染的35天后接受每天两次10 mg/kg剂量的NF6702，治疗20天后即可控制寄生虫水平，效果和苄硝唑（因强烈副作用不得不中断治疗）100mg/kg的效果相当。甚至有一只小鼠的血液、结肠、心脏组织检测不到寄生虫。

昏睡病：受血脑屏障的限制，仅有10%的药物进入脑组织。提高剂量至10倍，显而易见地清除了血液中的寄生虫，治疗7天后，也可持续清除寄生虫。在实验结束时，没有在大脑中检测到寄生虫，这优于三氮脒的治疗效果，如图8。

图8. 抗昏睡病效果。图片来源：Nature

数据证明，GNG6702在4种小鼠模型中都有非常好的抗寄生虫效果。

药物靶标：蛋白酶体

蛋白酶体普遍存在于真核生物和细菌中，主要作用是降解细胞内不需要或受到损伤的蛋白质，包括多个亚基，具有多种蛋白水解活性。蛋白酶体活性是寄生虫生长的关键因素。克氏锥虫的蛋白酶体具有三种蛋白水解活性，通过基因测序以及基因突变等技术，研究团队发现化合物GNF6702仅抑制蛋白酶体的类胰凝乳蛋白酶活性（IC₅₀ = 35 nM），对另外两种活性——类胰蛋白酶活性和类caspase活性则没有明显作用（IC₅₀ 值都大于10 μM），这不同于哺乳动物蛋白酶体抑制剂硼替佐米（bortezomib），后者能同时抑制这三种蛋白水解活性。

随后实验结果证明，GNF6702正是通过抑制锥虫蛋白酶体的类胰凝乳蛋白酶活性来抑制寄生虫增殖。而且GNF6702的抑制锥虫蛋白酶体的机制也不同于硼替佐米，是非竞争性抑制机制，也就是说，GNF6702并不直接影响酶和底物的结合。结构研究也证明了这一点，GNF6702通过结合蛋白酶体β4亚基（proteasome beta 4 subunit，PSMB4），从而对类胰凝乳蛋白酶活性所在的蛋白酶体β5亚基产生变构抑制（见图9）。（说通俗点，GNF6702的抑制类似于“隔山打牛”，结合在β4亚基，却导致β5亚基上的活性位点结构受到影响，从而产生抑制活性）