无心插柳柳成荫：JACS报道液泡ATP酶共价调节剂的发现

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液泡ATP酶（Vacuolar ATPase）是调控细胞内pH值的分子器件。它通过结合并水解ATP获取能量，实现对质子的膜间主动运输，进而调节跨液泡膜的物质转运等一系列生物过程。液泡ATP酶的失调与多种疾病息息相关，是潜在的药物靶点。然而，该酶的具体机制及生理作用还有大量未被阐明的问题。这一部分归因于作为一个拥有十个以上亚基的跨膜蛋白，该蛋白复合物结构上的复杂性令人望而生畏，另一部分也是因为现阶段已发展出的化学调节剂仍存在作用位点未知的问题，限制了对其机理上的解析。

近日，南加州大学的Chao Zhang博士等人在J. Am. Chem. Soc.上发表文章，报道了一个液泡ATP酶的共价调节剂，为研究该蛋白复合物提供了一把利器。

图片来源：J. Am. Chem. Soc.

这个V-ATPase的调制剂的发现可谓美丽的意外。Zhang实验室一直致力于研究激酶的共价抑制剂。不久之前，该组报道了由喹唑啉（quinazoline）的衍生物2（图1A）出发，修饰其苯环，从而得到受体酪氨酸激酶EphB3的高效专一抑制剂的成果^[1]。为了进一步研究这一系列化合物在细胞中的靶向特异性，研究人员合成了带有炔基的化学探针1（图1A），并将其加入到HEK293H活细胞培养液中，之后对细胞进行裂解，通过Cu(I)催化的叠氮-炔环加成反应对该探针靶向的蛋白进行荧光修饰。结果表明，该探针具有很高的特异性，在适当的浓度下仅共价修饰少数蛋白（图1B）。有趣的是，其中一个分子量约为70 kDa的未知蛋白总是脱颖而出，可以在五分钟内高效地与1反应（图1C）。该相互作用还会被化合物2竞争（图1D），表明了这个未知的p70蛋白是化合物1与2的特异靶标。

图1: 化学探针1在HEK293H细胞中高效、专一、快速地对一个未知蛋白进行标记。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

为了探究这个未知蛋白的身份，作者们将荧光试剂换成了带生物素的亲和试剂，从而对p70蛋白进行pull-down富集（图2A），并采用LC-MS/MS的方法进行表征。结果令人感到意外，这个p70蛋白并非作者们熟悉的激酶，而是液泡ATP酶的一个催化亚基（图2B）。为了进一步确认，研究人员通过免疫印迹试验仔细求证，再次确定了探针1的靶标便是液泡ATP酶催化亚基A（ATP6V1A）（图2C）。至此，作者们从一个激酶抑制剂的衍生物出发，原本期望对该系列抑制剂在活细胞中的特异性进行表征，却偶然发现该衍生物作用于一个液泡ATP酶的性质，这一波三折的发现历程不可谓不有趣。

图2: p70蛋白被鉴定为液泡ATP酶的催化亚基A（ATP6V1A）。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

接下来作者们试图阐明化学探针1与ATP6V1A蛋白的作用机理。根据探针1的亲电性质及之前的研究成果，作者们猜想该作用存在于探针1的氯乙酰胺部分与蛋白质半胱氨酸上的巯基之间。为了验证该猜想，作者们分别将没有被埋在蛋白内部的五个半胱氨酸进行变异，结果发现只有在Csy138是探针1特异性修饰的位置（图3A-C）。Csy138存在于一个调节ATP酶复合物整体组装与分离的重要区域NHR，对该区域的另外几个序列保守的位置进行变异也会破坏探针1的抑制作用（图3D）。至此，在没有晶体结构的辅助下，作者们通过蛋白质定点变异的方法确定了化学探针1的大致作用机理。

图3: 对ATP6V1A中与化学探针1相互作用的位点的识别。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

由于受凝胶成像的方法的灵敏度的限制，作者们并无法完全排除化学探针1不与其他低丰度的蛋白也有高效的相互作用。为了探索这个问题，Chao Zhang课题组与斯克里普斯研究所的Benjamin F. Cravatt课题组合作，绘制了该化合物的蛋白质活性作用谱（activity-based protein profiling, ABPP）（图3A-B），结果发现ATP6V1A的Cys138位点鹤立鸡群，验证了探针1的特异性。

最后，手握如此高效的共价调节剂，研究人员随即与研究ATPase多年的哈佛医学院Dennis Brown课题组合作，展开对其应用的研究。展开对其应用的研究。在第一个应用里，作者们借助探针1，对多年前被发现但未知具体原理的一个液泡ATP酶抑制剂3-BP进行了机理研究，发现该抑制剂与探针1之间存在直接的竞争关系（图3C），间接阐明了该抑制剂同样作用于NHR区域。在另一个应用中，作者们借助pH荧光探针对化合物1和2在活细胞中作用产生的表型进行了研究^[2]，结果发现在液泡ATP酶被一个天然抑制剂bafilomycin抑制活性之后，化合物1的加入可以阻遏其活性的恢复，从而抑制了液泡内部的重新酸化。这个结果表明，化合物1提供了一项在活细胞中调节液泡ATP酶的活性的有力工具，而且由于已知其作用位点，这将有利于对ATP酶的活性机制的精确解析。

图4: 喹唑啉衍生物1与2展现蛋白质组层面上的高选择性，揭示了液泡ATP酶抑制剂3-BP的作用机制，并在活细胞中抑制液泡的重新酸化。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

Y评：

这个高效特异的共价调节剂的发现与表征无疑为液泡ATP酶的研究提供了有力的工具，我们也大可期待其应用于更多生物问题上的研究与解答。抛开这个探针对生物研究的价值不提，关于该探针的这项研究本身十分有趣，能启发灵感。Chao Zhang课题组向我们生动地展示了当实验结果出乎意料，并且将研究人员带入全新的陌生领域时，研究人员该如何应对的问题。停留在自己的熟悉领域，专心致力于属于该实验室的“正轨”的研究，或许有利于孜孜不倦地对一个问题进行钻研，并最终开花结果。但有时大胆踏出自己的舒适带，运用扎实的科学技能对未知领域进行探索，同时积极与其他领域的专家展开合作，协力把一个故事讲完整，也未尝不是柳暗花明又一村的一种选择。

参考文献：

1. J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 10554-10560, DOI: 10.1021/jacs.6b05483

2. Sci. Rep., 2015, 5, 14827, DOI: 10.1038/srep14827

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Covalent Modulators of the Vacuolar ATPase 

J. Am. Chem. Soc., 2016, DOI:10.1021/jacs.6b12511

导师介绍

Chao Zhang

http://www.x-mol.com/university/faculty/1908

（本文由YChemBio供稿）

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