【分析】基于pH响应的微小RNA试纸检测

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微小RNA是一类广泛存在于真核生物体内长度为20～23个核苷酸的内源性非编码RNA。近年来的研究表明，微小RNA的异常表达与许多人类的癌症相关，如肺癌、肝癌、乳腺癌和胃癌。因此，将微小RNA作为一种潜在的肿瘤标志物用于癌症的早期诊断并针对微小RNA标志物发展简单、特异、灵敏的检测手段是当前研究的热点。目前，大多数技术手段包括称为“金标准”的实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）都需要在中心实验室完成，难以满足即时检测（point-of-care testing, POCT）对即时性、便捷性、低成本等方面的需求。南京大学/上海大学的李根喜教授、朱小立副研究员等最近提出了一种可使用pH试纸检测微小RNA的新方法，较好地弥补了上述缺陷。

该方法依赖于他们自主研发的网状滚环扩增技术（netlike rolling circle amplification, NRCA）（Analyst, 2015, 140, 74; Theranostics, 2017, 7, 31）。利用该技术，作者可在恒温条件下短时间内将微量的微小RNA扩增为大量的长链序列并呈现出致密的网络结构。其优势主要包括：（1）可在恒温下进行，因此无需使用精密的热循环仪；（2）扩增效率高，在最适宜的条件下可媲美PCR的扩增效率；（3）适合短片段核酸靶标的扩增且序列设计方便。此外，由于在扩增过程中，DNA聚合酶以脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）为底物，沿着5'→3'的方向催化DNA的合成，并释放出焦磷酸和氢离子，氢离子的释放量与扩增效率呈正相关。因此，通过使用弱缓冲体系并优化相关的条件，高效的NRCA在微小RNA的扩增中可实现检测体系pH的显著降低，从而为使用pH试纸即可检测微小RNA奠定了基础。李根喜教授、朱小立副研究员等分别尝试使用了三种pH敏感的指示剂（甲酚红、中性红、间甲酚紫）来监测反应体系的pH变化，通过肉眼及紫外-可见分光光度计观测指示剂颜色的变化，从而实现了微小RNA（miR-21）的可视化定量检测。得益于NRCA高效的扩增效率，该方法与基于传统的等温扩增技术如超分支滚环扩增技术（HRCA）、链置换扩增术（SDA）所获得的结果相比，肉眼可视的分辨率分别提高了100倍和10倍，达到100 fM级，颜色区分度也得到了显著提升，从而大大加强了临床检测的可行性。同时，他们的研究也表明，基于上述pH响应的NRCA体系，利用商品化的pH试纸即可满足微小RNA定性及半定量检测的需求。这一成果为微小RNA的即时检测提供了可能性，同时也为其他病毒或核酸肿瘤标志物的检测提供了新思路。

图1. 基于pH响应的微小RNA检测原理示意图。（A）网状滚环扩增技术（NRCA）的原理；（B）DNA聚合酶催化的扩增反应；（C）pH指示剂在不同pH下的颜色变化；（D）通过pH试纸检测微小RNA进行癌症诊断。

图2.（A）利用pH指示剂甲酚红比较不同靶标浓度下的超分支滚环扩增（HRCA）、链置换扩增（SDA）、网状滚环扩增（NRCA）三种恒温扩增方式的颜色变化（Critical point：肉眼可见颜色变化的临界点）；（B）利用pH指示剂甲酚红和pH试纸对不同癌细胞中微小RNA-21的可视化检测。

该成果近期发表在Analytical Chemistry 上，文章的第一作者是博士研究生冯畅，研究工作得到了国家自然科学基金重点及面上项目的支持。

该论文作者为：Chang Feng, Xiaoxia Mao, Hai Shi, Bing Bo, Xiaoxia Chen, Tianshu Chen, Xiaoli Zhu and Genxi Li

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：

Detection of microRNA: A Point-of-Care Testing Method Based on a pH-Responsive and Highly Efficient Isothermal Amplification

Anal. Chem., 2017, 89, 6631, DOI: 10.1021/acs.analchem.7b00850

导师介绍

李根喜

http://www.x-mol.com/university/faculty/43036

朱小立

http://www.x-mol.com/university/faculty/43037

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