Nature：看今年化学诺奖得主如何做碳氢键官能化- 大数跨境

X-MOL资讯

2018-12-24

导读：Frances Arnold教授课题组利用酶的定向进化策略，再次做出了“超乎想象”的反应。他们通过对细胞色素P450的定向进化得到改造酶，可以高效催化通过卡宾碳氢插入进行的选择性sp3 C‒H键分子间

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今年十一假期期间公布的2018年诺贝尔化学奖（相关阅读），一半授予加州理工学院的Frances H. Arnold教授，表彰她在“酶的定向进化”领域中的开创性贡献（相关阅读：诺奖弟子跟你聊聊“定向进化”那些事），另一半授予George P. Smith教授和Gregory P. Winter爵士，表彰他们在“肽和抗体的噬菌体展示技术”中的卓越成就。奖项公布后，X-MOL就进行了报道，不少读者依然像往年一样抱怨“化学奖”沦落成了“理综奖”，但不少熟悉Arnold教授工作的读者却表达了不同的看法，其中一位的留言，笔者就觉得很有道理——

最近，Frances Arnold教授课题组利用酶的定向进化策略，再次做出了“超乎想象”的反应。他们通过对细胞色素P450的定向进化得到改造酶，可以高效催化通过卡宾碳氢插入进行的选择性sp³碳氢键分子间烷基化反应。碳氢键官能化是有机化学领域的研究热点，这一工作再次证明了定向进化技术的强大功能和极其广泛的应用前景。

图1. Frances Arnold（首排右四）课题组照片，首排右二为该文章一作Ruijie Zhang。图片来源：Arnold Group

在Arnold课题组近五年的工作中，他们多次利用“定向进化”改造细胞色素P450、细胞色素c、球蛋白等含有血红素辅基的蛋白质，使之能催化非天然的卡宾和氮卡宾迁移反应，比如环丙烷的合成（Science, 2013, 339, 307），高张力的双环丁烷的构建（Science, 2018, 360, 71，点击阅读详细），碳‒硅键（Science, 2016, 354, 1048，点击阅读详细）和碳‒硼键（Nature, 2017, 552, 7683，点击阅读详细）等非天然化学键的构筑。与此同时，往往也有不少人会问，能不能改造这一系列酶进行卡宾的碳氢插入反应？虽然碳氢键的直接官能化在贵金属催化的体系中已经可被很好地实现，但铁作为储量丰富的第一过渡系金属却鲜有催化卡宾碳氢插入反应的例子报道。这很可能是因为反应过渡态能垒太高，实现立体选择性也比较困难。然而，蛋白质结构通过精细的调控往往能够稳定高活性中间体，降低反应能垒，从而也实现立体选择性。即便如此，UC Berkeley的有机化学家John Hartwig认为铁中心形成的卡宾体难以进行有效的碳氢插入反应，因此他们采用了金属辅酶替换的手段把中心铁原子换成金属铱（Ir）（图2a），从而使目标反应有效的进行（Nature, 2012, 534, 534，点击阅读详细；Science, 2016, 354, 102，点击阅读详细）。然而，Arnold课题组认为，辅酶替换过程过于复杂繁琐，难以进行快速的定向进化，而且依旧需要贵金属铱，这样的策略不尽完美。而且，他们相信定向进化可以重塑蛋白质的内部结构，使之有利于铁催化的反应的发生（图2b）。

图2. 金属辅酶替换策略和定向进化策略用于卡宾碳氢插入反应。图片来源：Nature

作者以对甲氧基苄甲醚和重氮乙酸乙酯作为底物对不同的血红素蛋白以及它们的突变体进行筛选，发现一个轴向配体残基突变为丝氨酸的细胞色素P450的突变体P411 P-4 (A82L) 对目标反应有微弱的活性，催化转换数（TTN）为13（图3a）。经过14轮的“定向进化”之后所得到的突变体P411-CHF对目标反应在催化活性上有了140倍的提升（2020 TTN），且立体选择性很好（96.7:3.3 e.r.）。而且，就算不从工程菌中提取纯化P411-CHF蛋白质，而是直接使用含P411-CHF的细菌细胞作为催化剂，对毫摩尔级别的反应同样表现出了非常好的催化活性（1060 TTN），实现了非常好的收率（82%）和立体选择性（98.0:2.0 e.r.）（图3b）。能直接利用表达目标蛋白质的细胞作为催化剂，无需对蛋白质进行分离纯化，这将大幅简化酶在有机反应中的使用。

图3. 酶的筛选以及定向进化。图片来源：Nature

在此之后，作者对底物范围进行了测试，发现这一新的突变体P411-CHF对不少不同取代的或是不同结构（环状或直链）的苄醚类或者烷基苯类底物都能有很好的催化活性（数百到上千的TTN）以及良好的立体选择性（图4a）。值得一提的是，即使当底物中包含普遍认为更易发生硅氢插入的硅氢键时，卡宾的碳氢插入（3h）仍能优先进行。酶能够被调控实现化学多样性这一特点更在含烯丙基的底物1m上得以体现：P411-CHF做催化剂时，以高立体选择性得到了卡宾碳氢插入的产物；然而，另一个细胞色素P450突变体P-I263F却催化了烯烃环丙烷化反应（图4b）。从同一个原始蛋白质出发，经过不同的进化得到的突变体，能对同一个底物催化不同的反应——定向进化策略大幅拓宽了酶的可调控性。

图4. 苄位碳氢插入的底物范围以及酶的可调控性。图片来源：Nature

紧接着，作者又探究了P411-CHF是否能用于结构差异更大的底物的碳氢插入反应。令人惊讶的是，链状底物的烯丙位、炔丙位碳氢键都能发生目标卡宾迁移反应，并给出了非常好的立体选择性，最高TTN达到3750（图5a）。这一结果与其他过渡金属催化的体系大不相同：尤其在铑催化的卡宾迁移反应中，双键的环丙烷化或叁键的环丙烯化往往更容易发生。烯丙位碳氢插入的反应也能够被轻松放大到2.4毫摩尔级别，以87%的收率得到产物5a，经氢化、水解两步反应以当量收率得到中间体6，结合Phil Baran的脱羧烯基化策略可用于合成天然产物Lyngbic acid。

此外，作者也发现酶催化的卡宾碳氢插入能够在氮-α-位的碳氢键发生（图5b）。虽然氮-α-位的碳氢键键能高于苄位碳氢键，但碳氢插入仍优先在氮-α-位的甲基或者亚甲基上发生；若氮-α-位上同时连接甲基或者亚甲基，碳氢插入首选在亚甲基位置。此外，对于底物7f，另一个在进化过程中的P450突变体P411-gen5也能催化目标反应，而且与P411-CHF实现了相反的立体选择性——体现了酶能够被调控实现立体多样性这一特点。基于产物8f，经还原、卤素交换、铃木交叉偶联三步反应以50%收率得到天然产物Cuspareine。

图5. 烯丙位、炔丙位以及氮-α-位的碳氢插入的底物范围和天然产物的合成。图片来源：Nature

——总结——

Frances Arnold教授课题组采用酶的定向进化实现了通过卡宾碳氢插入进行的选择性sp³ 碳氢键分子间烷基化反应。从同一个原始蛋白质出发，通过不同进化过程得到的不同突变体，对于同一底物可催化不同的反应，或者在同一底物同一反应中得到不同的立体选择性。这一工作展现了“定向进化”的极大潜力以及广泛的应用价值。即使是化学家们传统认知中非常困难的反应，比如该文章中的铁卡宾碳氢插入反应，“定向进化”的策略往往能够通过对目标蛋白质进行快速高效的优化而实现这些转化。对于这些具有挑战性的反应，传统的有机催化化学往往更依赖于精巧的配体设计、复杂的分子模型等；与此不同，生物技术辅助下的“定向进化”策略能快速生成数以万记的蛋白质突变体用于筛选，往复多轮便能轻松改造酶用于实现目标反应，也能轻松调控实现酶的多样选择性（立体/区域/化学选择性）。此外，这篇文章所关注的碳氢键并没有涉及到完全惰性的碳氢键，但这或许只是Arnold课题组对酶用于碳氢键官能化探索的第一步——相信他们会在不久的将来继续用“定向进化”的策略攻克一级、二级甚至三级惰性碳氢键的官能化。

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