注：文末有本文科研思路分析
核酸、蛋白质和糖是生命体内的三大主要聚合物大分子。对这些生物大分子的研究有助于揭示生命体的各种生理和病理现象，同时，核酸、蛋白质（多肽）和糖在医药工业上还具有很多重要的应用。因此，怎样大量高效地获得这些生物大分子成为无数研究者追求的目标。目前，核酸与多肽的自动合成技术平台已经成熟。通过使用商业化的核酸与多肽合成仪，非专业合成科研人员也可以很方便地合成大量的核酸与多肽。自动化合成技术的发展极大地促进了相关学科的发展，同时催生了大批核酸和蛋白药物。
然而不像核酸和蛋白，寡糖的组成单体并非由少数几种残基以固定的方式连接而成。组成寡糖的单糖种类以及单糖之间的连接方式极其多样，导致寡糖的合成远比核酸和蛋白的合成困难，这也是至今尚无成熟的商业化自动合成平台可以用来合成寡糖的直接原因。目前化学法和酶法是合成寡糖的主要方法。化学法可以通过对化学合成路线的设计来合成天然存在的或者非天然存在的寡糖。酶法合成主要是利用糖基转移酶实现寡糖的逐步延伸。近些年来，德国马普研究所的Seeberger教授课题组开发了基于化学法延伸的寡糖自动合成平台，实现了对大量寡糖的自动化合成。但是化学合成需要种类繁多的单糖模块，反应步骤需要大量的保护和去保护操作，导致反应效率低下，糖苷键的构型控制也很复杂，这些限制了寡糖合成仪的推广使用。相对于化学法，酶法合成寡糖条件温和，不需要保护和去保护的操作，更重要的是仅使用少量的糖基转移酶通过简单的排列组合便可以合成数以千计的寡糖。人类基因组中大约有二百多种糖基转移酶，负责细胞表面大量寡糖分子的合成（保守估计人类细胞表面有几万种糖类分子）。因此，开发基于酶法合成的寡糖自动合成平台有着广阔的应用前景。实现基于酶法的寡糖自动合成延伸的核心问题就是将每一步酶催化的反应产物分离出来，参与下一步酶催化的延伸反应。毫无疑问，固相合成分离技术是解决这一问题的理想技术方案。核酸和多肽的自动合成正是基于固相合成分离才实现了自动化延伸。目前研究较多的基于化学延伸的寡糖自动化合成也是利用固相合成技术，然而当寡糖连接到固相载体上时，大多数糖基转移酶或者寡糖水解酶并不能识别或者反应效率大大降低，主要是因为酶催化的反应在水相中进行。
近日，佐治亚州立大学的王鹏教授和文留青博士带领的研究团队利用温敏树脂成功实现了基于酶法寡糖的自动合成。在该研究中，作者将寡糖延伸的起始引物（一般为单糖或者二糖）与一种温敏材料（Poly(N-isopropylacrylamide，PNIPAM）连接。当环境温度低于临界溶解温度(LCST)，PNIPAM可以同水分子形成氢键，树脂由此可以溶于水中，不会影响糖基转移酶对底物的识别，酶反应顺利进行。当温度升高至高于临界溶解温度，这种分子间的氢键就会断裂，树脂聚集形成分子内的氢键从水相中沉淀出来（图1）。这样就可以像固相分离一样将树脂以及与树脂相连接的寡糖产品分离，用于下一步延伸反应。该温度控制的过程可以通过简单改造过的多肽合成仪（Liberty Blue多肽合成仪）实现。糖基转移酶与其他反应原料（金属离子、糖核苷酸等）可以储存在存放氨基酸的试管中。反应过程以及分离纯化过程在反应釜中由微波加热器通过调节温度进行控制（图2）。
图1. PNIPAM溶解与沉淀原理示意图
图2. liberty blue多肽合成仪
该系统简单易懂，同时易于操作，装载有初始寡糖的树脂预先加入到反应釜中，合成仪自动将糖基转移酶与其他试剂加入反应釜中，在25 ℃下进行酶反应，当反应完成，开启微波加热，将体系温度升高至90 ℃，带有寡糖的树脂从水溶液中沉淀，加压过滤除去其余试剂，由此完成一个循环（图3）。通过设置，他们可以将不同的糖基转移酶与对应的糖核苷依次进行同样的循环反应，多个循环后就可以得到目标寡糖，然后将寡糖从树脂上洗脱。作者选择了5种重要的复杂寡糖来测试该自动合成系统，成功实现了5 mg到20 mg规模的自动合成。
图3. 酶法自动合成寡糖的基本原理
这一成果近期发表在Angewandte Chemie International Edition 上，并被选为hot paper和目录首页。文章的第一作者是佐治亚州立大学的博士研究生张家彬，通讯作者是王鹏教授和文留青博士。
该论文作者为：Jiabin Zhang, Congcong Chen, Madhusudhan Reddy Gadi, Christopher Gibbons, Yuxi Guo, Xuefeng Cao, Garrett Edmunds, Shuaishuai Wang, Ding Liu, Jin Yu, Liuqing Wen, Peng G. Wang
原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：
Machine‐Driven Enzymatic Oligosaccharide Synthesis by Using a Peptide Synthesizer
Angew. Chem. Int. Ed., 2018, 57, 16638, DOI: 10.1002/anie.201810661
导师介绍
王鹏
https://www.x-mol.com/university/faculty/49735
文留青
https://www.x-mol.com/university/faculty/49920
科研思路分析
Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？
A：多肽与寡核苷酸合成仪的广泛使用可以让非专业人员大量生产多肽与寡核苷酸，极大促进了现代生物学与药学的发展。我们的目的是设计开发一台同多肽与寡核苷酸合成仪相似的、可用与全自动酶法糖合成的商用仪器，其能够让非专业人员经过短暂的培训用以合成寡糖。
Q：研究过程中遇到哪些挑战？
A：该课题最大的难点是以往的研究发现采用与自动合成多肽与寡核苷酸相同的固相合成法，酶反应的转化率不理想。反应中的酶和固相树脂之间识别困难。同时，许多课题组发现水溶性的树脂能够完美地进行酶反应，但是水溶性的树脂增加了反应后的纯化难度。因此，我们课题组采用上述温敏材料完美解决了这两个难题。
Q：该研究成果可能有哪些重要的应用？哪些领域的企业或研究机构可能从该成果中获得帮助？
A：该研究提供了一种新的思路用以自动合成寡糖。这种仪器可以合成化学法难以合成的天然存在的寡糖，与人工酶法合成寡糖相比，机器可以不停地工作，同时简化了纯化环节，可大量生产具有生物活性的寡糖用以生理药理的研究。因此，这种仪器可以极大地促进糖科学的发展，同时让生物与医药行业受益。
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