甲醛是工业生产中常用的原料，也是生活环境中常见挥发性污染物和公认的致癌物之一。除了外源性的甲醛外，甲醛也是体内的重要一碳代谢产物，是一些氨基酸和DNA碱基生物合成中必需的一碳合成单元，也与DNA和组蛋白的去甲基化、基因调控、癌症和阿尔茨海默症等生理病理过程密切相关。由于甲醛在体内生成与转化的内平衡受相关过程不同酶的调控，作为可能的体内信号传递分子，其浓度的时空变化与其生物活性的内在关联关系非常重要但还不甚清楚。而荧光给体，作为功能性荧光分子工具，通过可控释放特定物种同时通过荧光信号对所释放的剂量进行方便的定量、跟踪和荧光成像研究，特别适用于研究信号传递分子的剂量的与生物活性的量效关系。近年来，已有多种生物活性分子如一氧化氮（Anal. Chem., 2018, 90 , 2164-2169.）、一氧化碳（Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55 , 15846-15851）等的荧光给体被陆续开发和报导。最近，华东理工大学的王卫课题组首次报导了pH敏感型释放甲醛的荧光给体分子NAP-FAD-1，并验证了其具有优异的溶酶体靶向释放甲醛性能。
该荧光给体NAP-FAD-1的分子来自于该课题组发表在《美国化学会志》再生型甲醛荧光探针的前期工作（J. Am. Chem. Soc., 2018, 140, 16408-16412）。甲醛荧光探针NAP-FAP-1在pH 7.4的缓冲溶液中，其荧光产物4可以与甲醛进一步发生平衡反应生成无荧光的缩胺醛副产物，导致荧光检测信号的减弱。而在pH 5.0的酸性条件下，几乎不发生荧光信号的减弱。由此，作者推测该缩胺醛副产物NAP-FAP-1可能是pH敏感型甲醛荧光给体，可通过平衡移动释放甲醛并生成荧光产物4（Fig. 1）。在本工作中，作者对其甲醛释放和荧光信号读出性能进行了验证并进行了初步生物学应用研究。
首先，文章作者发现在pH 7.4 PBS缓冲溶液中，50 μM NAP-FAD-1与2 μM甲醛荧光探针NA-FA共培养，可以同时观察到给体生成的荧光产物的荧光信号（470 nm）和甲醛荧光探针的荧光信号（543 nm）的随时间增强（Fig. 2a-c），验证了NAP-FAD-1的确可以作为甲醛荧光给体。随后，通过对pH 7.0和5.0条件下的荧光产物470 nm处荧光强度的变化（Fig. 2d），可以得知该甲醛荧光给体在酸性条件下更容易释放甲醛，是一个pH敏感型甲醛荧光给体分子。
随后，对荧光给体NAP-FAD-1可能的生物效应进行了探索。在人类Jurkat T-淋巴细胞的MTT实验中，荧光给体表现出了比其荧光产物更高的细胞毒性（Fig. 3a），进一步通过酶标仪实验表明在MTT实验的细胞培养条件下，的确发生了甲醛的释放（Fig. 3b），说明给体更高的细胞毒性很可能与其甲醛释放有关。为进一步验证给体是否能在细胞内释放甲醛，Jukat细胞先用荧光给体培养后，然后再没有外加给体的细胞培养液中培养，也观察到了随时间增加的荧光增强，说明了该荧光给体能在细胞内释放甲醛，可以通过荧光信号对其在细胞内的甲醛释放进行研究。
作者接着利用荧光共聚焦显微镜对荧光给体NAP-FAP-1释放甲醛后荧光产物在HeLa细胞内的分布进行了研究（Fig. 4），发现产生的荧光（蓝色通道）和商用溶酶体荧光探针Lyso-Tracker Red的荧光（红色通道）有很高的共定位性（Pearson's 系数0.96），说明荧光产物基本富集在溶酶体中。由此可以得出荧光给体NAP-FAP-1具有优异的靶向溶酶体释放甲醛性能，可用于溶酶体中甲醛释放与其生物学效应的研究。
最后，作者对所观察到的甲醛荧光给体的高溶酶体靶向释放甲醛现象提出了可能的解释（Fig. 5），认为给体本身容易穿过溶酶体膜，在溶酶体的酸性环境中释放甲醛生成的荧光产物为两性离子，不容易穿过溶酶体膜，导致荧光产物在溶酶体中富集。另外，由于给体的甲醛释放是一个平衡过程。给体在溶酶体中释放的甲醛可能穿透溶酶体膜迁移到细胞质中，提高了细胞质中甲醛的浓度，通过平衡移动进一步抑制细胞质中给体的甲醛释放，而溶酶体中甲醛因为迁移到细胞质中降低了溶酶体中的甲醛浓度，从而通过平衡移动促进溶酶体中甲醛的释放，降低了溶酶体中给体的浓度，进一步促使更多的给体分子从细胞质迁移到溶酶体中释放甲醛。该荧光给体通过pH敏感的反应-富集和溶酶体中释放的甲醛的正反馈的双重机制，从而表现出优异的靶向溶酶体释放甲醛性能。
该成果近期发表在Chemical Communications 上，文章的第一作者是华东理工大学的博士生徐航，通讯作者为华东理工大学药学院的王卫教授、楼开炎副教授和徐缓副教授。
A Naphthalimide-Aminal-based pH-Sensitive Fluorescent Donor for Lysosome-targeted Formaldehyde Release and Fluorescence Turn-on Readout
Hang Xu, Shengnan Ma, Qianqian Liu, Lixian Huang, Peimin Wu, Xiaolin Liu, Yali Huang, Xiaolei Wang, Huan Xu, Kaiyan Lou, Wei Wang
Chem. Commun., 2019, 55, 7053-7056, DOI: 10.1039/c9cc02481f
https://www.x-mol.com/university/faculty/17845
A：该研究中的甲醛荧光给体分子是前期工作甲醛再生荧光探针研究中分离得到的副产物，由于其荧光淬灭，对荧光探针的检测来说不利。通过反复思考和设计，该分子也能够通过释放甲醛生成荧光产物，由此可作为甲醛荧光给体分子。此外，通过对荧光探针分子在不同pH条件下的荧光响应分析，从酸性条件下，几乎没有副产物的生成，推测该副产物很可能是pH敏感的甲醛荧光给体。本工作通过实验验证了之前的推测，并对该pH敏感甲醛荧光给体分子的生物学应用进行了初步的探索。
A：研究过程中遇到的挑战之一是需要寻找生物学应用场景来说明甲醛荧光给体的确可以帮助建立甲醛释放和生物学效应之间的量效关系。在文章中，我们建立了给体与荧光产物相比更高的Jurkat细胞毒性与其甲醛释放的量效关系。通过酶标仪实验说明了MTT实验条件下，荧光给体的甲醛释放具有浓度和时间依赖性，并且给体分子在细胞内的甲醛释放也具有浓度和时间依赖性。
研究过程中遇到的另一个挑战是如何合理解释我们所观察到的给体的优异的溶酶体靶向释放性能，而给体本身并不含溶酶体靶向基团。特别是考虑到在体外实验中，荧光给体可以在pH 7.4的PBS缓冲液中释放甲醛。我们提出了反应-富集机制和甲醛从溶酶体中到细胞质中迁移引发的正反馈机制的双重机制来解释为什么该甲醛荧光给体虽然没有溶酶体靶向基团，却具有高溶酶体靶向释放甲醛性能的原因。
A：该工作是首个报导的甲醛荧光给体分子，主要的应用还是在基础研究，用于弱酸性环境包括溶酶体，肿瘤微环境，尿液等中甲醛的释放与其引起的生物学效应之间的量效关系研究。由于甲醛是潜在的信号传递分子，这种人工可控上调甲醛浓度并通过荧光对甲醛的释放进行荧光定量和跟踪的分子工具，将为甲醛的化学生物学研究提供重要的研究工具。该荧光给体分子也可以用于甲醛缓冲溶液的配制。
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