癫痫是常见的神经系统疾病，影响全世界约1%人口，其特征是异常神经元电活动而导致长期和不可预测的癫痫发作。约三分之一癫痫患者不能通过药物来控制发作，被称为难治性癫痫。与普通癫痫患者相比，难治型癫痫患者的死亡率、遭受物理创伤和心理障碍的风险显著增加。手术切除致痫灶是治疗难治性癫痫最有效的方法，但准确定位致痫灶是实施手术干预的前提。
脑电图是定位致痫灶的金标准，通过监测异常神经元放电定位致痫灶。然而，颅内脑电存在空间分辨率低、灵敏度不足、观察范围有限、费用高昂等缺点。此外，颅内电极插入不可避免地造成脑组织创伤。作为临床定位致癫灶最主要的影像技术，磁共振成像（MRI）通过组织结构异常发现致痫灶，还具有无创、无检测深度限制、分辨率高等优势。然而，约30%难治性癫痫患者在磁共振成像上未表现出结构异常，导致其失去手术治疗机会。全世界范围内，目前仅有不到1%的癫痫患者最终实现了手术治疗。因此，开发高特异性、高信噪比的磁共振探针是定位“隐匿型”致痫灶的迫切需求。
2020年9月28日，复旦大学药学院李聪教授联合复旦大学附属华山医院神经外科毛颖教授等在Nature Biomedical Engineering 杂志上发表了题为“An electric-field-responsive paramagnetic contrast agent enhances the visualization of epileptic foci in mouse models of drug-resistant epilepsy”（电场响应顺磁性造影剂可视化耐药小鼠癫痫模型致痫灶）的研究论文，报道了一类基于胶束结构的电场响应型磁共振探针。在小鼠局灶性癫痫模型中，该探针能够主动跨越血脑屏障进入病灶区域。癫痫发作引发的脑电场变化会触发探针结构破坏，并伴随T1加权磁共振信号显著性增强。该探针实现了急性和自发性小鼠癫痫病灶的准确定位，且T1磁共振信号增强与小鼠脑电强度正相关。该探针为增加难治型癫痫患者手术治疗机会，为研究癫痫相关脑疾病提供新的可视化技术。
图1. 电场响应磁共振探针的结构及响应机制。(a) 目标探针由顺磁性共聚物（外壳）包裹小粒径氧化铁团簇（内核）组成。(b) 由于距离依赖的磁共振谐调效应（distance-dependent magnetic resonance tuning，MRET），超顺磁氧化铁团簇的强磁矩导致空间相邻顺磁性基团的T1加权磁共振信号淬灭（OFF状态）。电场影响下，超顺磁和顺磁基团之间空间距离增加，顺磁性基团T1加权磁共振信号逐渐恢复（ON状态）。
该工作首先构建了一类具有胶束结构的电场响应探针。该探针呈“核-壳”状球形结构，内核为小粒径氧化铁簇，外壳标记有顺磁性基团和电流响应基团。在初始状态，顺磁基团受到空间相邻超顺磁基团影响，其电子自旋涨落速率受到抑制，T1信号处于淬灭状态。在外电场作用下，电流响应基团带上正电荷，静电斥力导致探针结构破坏，顺磁性基团受氧化铁超顺磁磁场影响减弱，电子自旋涨落速率加快，T1信号开启，从而实现电流信号响应性。注射后，探针首先靶向病灶血管内皮细胞高表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1），继而通过LRP1介导转胞吞作用跨过血脑屏障进入病灶。在异常脑电刺激下，探针T1信号显著性提高，进而指示癫痫病灶（图1）。
图2. 电场响应探针T1磁豫率与电场强度与通电时间正相关。（a）探针在外电场（200 μA）作用0 h、2 h及8 h后的TEM图像。比例尺= 50 nm和20 nm（嵌入图）。（b）探针在外电场（200 μA）作用0 h、2 h及8 h后的水合粒径。（c）探针在不同通电时间和通电强度下的T1加权磁共振图像。（d）探针的T1弛豫率随外电场施加时间和强度的变化。
正常情况下，目标探针呈球形结构，在外加200 μA强度电场作用2 h后，探针体积逐渐膨胀并发生破裂。通电8 h后，探针几乎完全降解，氧化铁团簇分散（图2a）。水合粒径结果显示，随着外加电场作用时间增加，探针水合粒径逐渐增大（图2b）。探针T1加权磁豫率（r1）与电场作用时间成正比。在200 μA电场作用30 min、2 h和8 h后，探针弛豫率分别升高9.2%、33.6%和57.2%，达到6.4、7.8和9.2 mm-1 s-1（图2c和d）。探针磁豫率还与电场强度正相关。外加电场强度从100 μA逐渐增加至200 μA及500 μA后，探针的r1值分别升高22.0%、33.6%和43.9%（通电2小时）。
图3. 电场响应探针示踪急性期小鼠模型癫痫病灶。（a）急性期癫痫模型小鼠及假手术模型小鼠颅骨脑电图。（b）急性期癫痫模型小鼠18F-FDG PET成像，箭头指向为低信号强度的癫痫病灶区域。（c）尾静脉注射具有相同Gd3+浓度（0.06 mmol/kg）的EM（电场响应探针），CM（参比探针）或Gd3+-DTPA之前及之后相应时间点的冠状位MR图像。箭头指向癫痫病灶。
针对活体研究，研究者首先构建了急性期癫痫小鼠模型。颅骨脑电显示同侧海马有高频率、低电压的节律性放电。而假手术组仅可见基线脑电信号（图3a）。发作间期18F-FDG PET成像显示模型鼠同侧海马摄取低，提示该区域可能有神经元的损伤或丢失（图3b）。将急性期癫痫小鼠模型随机分为三组，分别尾静脉给予钆剂量相同（0.06 mmol/kg）的电场响应探针EM、电场不响应探针CM或临床广泛使用造影剂Gd3+-DTPA，另设一假手术模型组作为阴性参比。如图3c所示，尾静脉注射EM 30 min后，癫痫小鼠同侧海马T1W MR信号明显增强，注射2 h后逐渐扩展至整个海马。参比Gd3+-DTPA组中，注射30 min后在同侧大脑也可见到轻微的T1W MR信号增强，这可能是由于癫痫病灶部位BBB完整性受损造成。而注射CM后，并未发现病灶部位MR信号明显的增强。T1磁共振信号强度定量统计结果表明，注射后2 h后EM在癫痫病灶中MR信号强度升高了29.1%，显著高于参比探针CM（13.2%，P = 0.012）。小分子Gd3+-DTPA代谢较快，在注射后30 min，病灶区域T1W MR信号增强最多，达9.2%。
图4. 电场响应探针示踪慢性自发性癫痫小鼠模型病灶。（a）慢性自发性癫痫小鼠模型的颅骨脑电图。（b）慢性自发性癫痫小鼠模型18F-FDG PET成像，箭头指向为低信号强度的癫痫病灶区域。（c）尾静脉注射具有相同Gd3+浓度（0.06 mmol/kg）的EM，CM之前及之后相应时间点的冠状位MR图像。箭头指向癫痫病灶。
慢性自发性癫痫小鼠模型与临床颞叶癫痫患者具有相似的组织病理学、脑电图和行为学特征。颅骨脑电显示同侧海马出现明显的高压同步尖峰波和孤立/突发性尖峰（图4a）。发作间期18F-FDG PET显示癫痫病灶侧有明显的低代谢区（图4b）。活体MR成像结果显示，在尾静脉给电场响应探针1 h后，可观察到同侧海马有明显的T1W MR信号增强（19.4%），并在2 h达到最大值（21.5%），同时对侧海马也未检测到明显MR信号（图4c）。对比CM组，在注射后2 h同侧海马的MR信号增强率（11.2%）低于EM组（P = 0.016）。以上结果表明，该电场响应探针EM可通过对慢性期自发癫痫小鼠模型发作间期的神经元放电响应来定位癫痫病灶。
图5. 癫痫小鼠模型脑电功率与电场响应探针MR信号增强正相关。（a，b）急性和慢性期癫痫小鼠脑部不同位点脑电图及脑电地形图。（c，d）急性和慢性癫痫小鼠尾静脉注射电场响应探针2 h后，冠状位T1W-MR图像和伪彩图。（e，f）在急性和慢性期小鼠癫痫模型中，各ROI中的T1信号强度增加百分比与脑内EEG相对功率呈正相关。
研究者继续研究致痫灶放电强度与探针磁共振信号增强之间的关系。首先，他们搭建了一套脑电图仪，焊制小鼠颅骨电极，将2个参比电极固定在小鼠小脑部位，四个记录电极分别位于同侧海马、对侧海马、同侧额叶、对侧额叶。将模型鼠置于透明鼠笼中，摄像头记录它们的行为学，同时记录它们的脑电信号。图5a-b显示，在急性期间，EEG波谱记录到同侧海马（ROI 3）有明显的棘波，该区域的EEG相对功率比对侧海马及额叶高1.2–3.0倍。类似的，在慢性癫痫小鼠模型中，癫痫病灶区的EEG可观察到高电压尖峰波，其EEG相对功率比其他三个部位高1.5–2.1倍。脑电地形图同样显示，不论是急性或是慢性癫痫模型ROI 3区域的脑电功率最高。癫痫小鼠模型的T1W MR图像显示，电场响应探针注射后2 h 后ROI3的信号增强程度最高（图5c和d）。通过绘制探针注射2 h后癫痫病灶的T1强度变化和相应的EEG功率，可以发现二者存在一定的线性关系（图5e和f），慢性期的线性关系较急性期拟合程度更高。以上研究进一步证实了电响应探针信号增强在急性和慢性癫痫小鼠模型中定位癫痫病灶的可行性。
本工作报道了一类电场响应性T1W磁共振造影剂，该探针通过对癫痫病灶神经元异常放电区域进行定位，有望实现“隐匿性”癫痫病灶的无创示踪，为扩大难治型癫痫患者人群手术治疗机会提供了新技术。该电场响应探针具有以下3点优势：（1）将不可见的脑神经元异常电信号转变为可视且直观的影像信号，提高术前定位致痫灶的操作性；（2）可在癫痫发作间期实现致痫灶定位，提高临床操作便利性；（3）用于T1磁共振成像，与临床结构、功能磁共振影像无缝匹配，提高诊断准确性。
图6. 电场响应磁共振探针定位难治性癫痫病灶示意图。探针首先通过LRP1介导转胞吞作用跨血脑屏障进入病灶。病灶区域过度神经元放电触发探针破裂，探针磁共振信号显著升高，实现癫痫区域的高信噪比定位。
该项目得到了国家自然科学基金（项目编号：81771895; 81971598; 81725009; 81501120）、上海市“脑与类脑智能基础转化应用研究”市级科技重大专项（项目编号：2018SHZDZX01）等项目的资助。复旦大学药学院李聪教授和复旦大学附属华山医院神经外科毛颖教授为本文的共同通讯作者。复旦大学药学院博士生王聪、华山医院硕士生孙琬冰和华山医院放射科张军主任医师为共同第一作者。研究团队还得到了浙江大学医学院田梅教授和张宏教授，中科院上海药物研究所高召兵研究员，帝国理工学院化学系Nicholas J. Long教授的帮助。
An electric-field-responsive paramagnetic contrast agent enhances the visualization of epileptic foci in mouse models of drug-resistant epilepsy
Cong Wang, Wanbing Sun, Jun Zhang, Jianping Zhang, Qinghua Guo1, Xingyu Zhou, Dandan Fan, Haoran Liu, Ming Qi, Xihui Gao, Haiyan Xu, Zhaobing Gao, Mei Tian, Hong Zhang, Jianhong Wang, Zixuan Wei, Nicholas J. Long, Ying Mao, Cong Li
Nat. Biomed. Eng., 2020, DOI: 10.1038/s41551-020-00618-4
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