氨基酸脱氢酶（AADHs）作为生物催化剂，在手性氨基酸的不对称合成中具有巨大的应用潜力。其中，α-AADHs已被广泛研究，并应用于手性α-氨基酸的工业化生产。β-AADHs同样可以用于手性β-氨基酸的不对称合成，但我们对这类酶还知之甚少。近日，中国科学院天津工业生物技术研究所朱敦明研究员、吴洽庆研究员带领的研究团队与中国科学院深圳先进技术研究院周佳海研究员及天津所盛翔研究员合作，解析了目前β-AADHs家族唯一已知成员的第一个晶体结构，并揭示了其催化机理，用以指导酶分子的理性设计，从而将获得的优异突变体应用于手性β-氨基酸高效不对称合成。
手性β-氨基酸是许多天然化合物和药物分子的重要砌块，其合成方法的开发已是研究的热点。由β-AADHs不对称还原胺化β-酮酸是获得手性β-氨基酸的有效、绿色合成途径。然而，目前已报道的β-AADHs只有赖氨酸降解途径中的L-赤式-3,5-二氨基己酸脱氢酶（3,5-DAHDH），且这类酶一般只对天然底物具有较好活性，严重限制了其合成应用范围。另外，如何在保持良好立体选择性的同时，扩大底物谱、提高酶的催化活性仍然是很大的挑战。为了省时、省力、高效地实现这一目标，了解目标酶的底物识别和催化机理是非常必要的。
近日，中国科学院天津工业生物技术研究所的团队实现了这一突破，成功解析了来源于Candidatus Cloacamonas acidaminovorans的3,5-DAHDHcca的晶体结构，并发现该结构与α-AADHs或天然氨脱氢酶（AmDH）具有很大不同之处。3,5-DAHDHcca的完整催化功能单元是同源二聚体，且活性中心恰好位于两个亚基聚合的区域；而已报道的α-AADHs、AmDHs的单亚基即可完成催化。
图1. 3,5-DAHDHcca的晶体结构。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.
随后的量子化学计算和突变研究，确证了关键的底物识别位点和催化位点，提出了相应的催化机理，3,5-DAHDHcca催化的氧化脱氨反应包括氢化物转移、亚胺和水合中间体的形成以及C-N键断裂四个步骤。其中，氢化物转移和C-N断裂是反应的限速步骤。本研究还发现，天然底物的去质子化的C5氨基同样可以作为质子受体，在水合步骤中活化水分子。这为3,5-DAHDH底物特异性的分子基础提供了非常有价值的见解，且为后期的酶分子改造工作提供了有力的指导。
图2. 3,5-DAHDHcca的催化机理。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.
该团队在前期工作获得的突变体E310G基础上，通过重建辅酶酰胺基团与附近残基的氢键相互作用，并重塑底物口袋以更好地容纳底物分子，最终获得了对底物(R)-β-高甲硫氨酸活力提高约200倍的突变体，这相当于野生型酶活力的1.8×104倍。底物谱测试结果表明该突变体对脂肪族底物(S)-3-氨基己酸和(S)-β-高赖氨酸有较好的催化活性。最终，利用优异突变体还原胺化β-酮酸，不对称合成(R)-β-高甲硫氨酸和(S)-3-氨基己酸的产率分别为93%和95%，ee > 99%，分离收率可达86-87%。
本研究不仅扩展了人们对β-AADHs唯一已知成员3,5-DAHDH底物结合和催化机制的理解，同时也表明了这种理性设计策略在β-氨基酸不对称合成中的潜力，为进一步合理设计新酶实现目标β-氨基酸的不对称合成奠定了基础，开辟了绿色合成β-氨基酸及其衍生物的新途径。
这一成果近期发表在Angewandte Chemie International Edition 上，文章的第一作者是中国科学院天津工业生物技术研究所博士研究生刘娜。
Crystal structures and catalytic mechanism of L-erythro-3,5-diaminohexanoate dehydrogenase and rational engineering for asymmetric synthesis of β-amino acids
Na Liu, Lian Wu, Jinhui Feng, Xiang Sheng*, Jian Li, Xi Chen, Jianjiong Li, Weidong Liu, Jiahai Zhou*, Qiaqing Wu*, Dunming Zhu*
Angew. Chem. Int. Ed., 2021, DOI: 10.1002/anie.202017225
Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？
A：手性β-氨基酸类化合物是合成许多药物的关键结构单元，是非常有价值的医药中间体。在前期研究工作中，我们采用结构域逐点扫描策略对3,5-DAHDHcca进行了改造及筛选，并且获得了底物谱较广的突变体（ACS Catal., 2015, 5, 2220-2224.）。然而，这些突变体的活力依然非常低。另外，由于没有该酶的相关晶体结构或同源性较高的结构，突变位点如何影响底物谱及酶催化活性的分子机制也就无从得知。因此，我们只有获得这类酶的晶体结构，了解它的底物识别及催化机制，才能突破进一步酶分子改造的瓶颈。我们的研究结果也表明，晶体结构和催化机理指导的分子改造策略是非常有效的，这为针对高价值目标化合物的新酶设计奠定了坚实的基础。
A：在研究过程中遇到的主要挑战是，未能获得3,5-DAHDHcca酶与β-氨基酸或β-酮酸小分子底物的复合物晶体结构。不过，我们获得了该酶与NADPH的复合物结构，辅酶的结合很好地指示出了酶的活性中心与底物口袋。由于酶在反应过程中是动态的、变构的，且一般认为脱氢酶在结合底物后，辅酶结合域和催化结构域会闭合以促进反应。幸运的是，我们获得了处于“闭合”构象且结合有辅酶的晶体结构。而量子化学计算在揭示底物识别、催化机理方面做出了很大贡献。
Q：该研究成果可能有哪些重要的应用？哪些领域的企业或研究机构可能从该成果中获得帮助？
A：天然存在的酶催化剂已经不能满足人们对于高价值化合物高效合成的需求，该研究成果可以为合理设计新酶实现相关手性胺类化合物的不对称合成奠定基础。我们研究团队在新型生物催化剂的发现与改造、生物催化反应机理的研究及其在有机合成反应中的应用方面已经积累了非常丰富的经验，这些研究成果可以为同领域的科学家们提供有价值的研究思路，同时可以应用于相关化工行业精细化学品的合成，为企业创造经济价值。
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