对于药物研发工作者而言，如何合成生物活性分子以及进行结构修饰一直以来都是焦点问题。众所周知，药物分子结构的微小改变会对其药物代谢活性带来巨大影响，其中最著名的要数“神奇的甲基效应（magic methyl effect）”。具体而言，当把分子中的一个氢原子换成甲基后，由于分子的亲脂性、三维形状及其构象柔韧性会发生变化，添加甲基后的分子就可能具有更高的活性和稳定性以及更低的毒性（图1A）。然而，向分子中添加甲基往往十分困难，经常需要使用相应甲基化的起始原料从头合成。相比之下，对目标分子的C-H键直接进行甲基化显然更高效，目前的最优方案是伊利诺伊大学香槟分校White课题组发展的由氧化-甲基化组成的两步策略（Nature, 2020, 580, 621–627，点击阅读详细）。但是该方法仍存在一些缺点，比如需要低温条件以及对空气敏感的AlMe3。
近日，美国威斯康星大学麦迪逊分校的Shannon S. Stahl教授课题组报道了一个在镍催化/光诱导条件下利用过氧化物单步实现C(sp3)-H键甲基化的新反应（图1B、1C），实现了多种药物分子及其结构单元中的C(sp3)-H键甲基化。如图1D所示，该反应的设计思路看起来并不复杂：首先，要选择合适的光敏剂，这是因为光敏剂可以被可见光激发到三线态，后者可以与过氧化物进行能量转移断裂O-O键，从而避免使用高温条件或者高能的紫外光照射；其次，在产生甲基自由基的同时，烷氧基自由基还可以诱导氢原子转移（HAT），从底物C-H键中攫氢生成碳自由基；最后，由于这两个瞬态自由基直接进行偶联非常困难，因此作者尝试向反应中添加过渡金属，后者捕捉到其中一个自由基后就会生成较为稳定的金属有机中间体，从而可以与另一自由基选择性偶联生成目标产物。相关研究近期发表在Science上。
图1. 研究背景及该文工作。图片来源：Science
首先，作者选择二叔丁基过氧化物（DTBP）为氧自由基前体、（3-苯基丙基）邻苯二甲酰亚胺为模板底物、乙腈为溶剂的条件下，对可见光光敏剂进行了筛选，并通过1H NMR光谱进行监测，结果显示反应效率与光敏剂三线态能量直接相关（图2A）。在无光敏剂时，反应的转化率仅为12%，说明了光直接对过氧化物的活化不是反应进行的主要途径；而使用三线态能量高于55 kcal/mol的Ir光敏剂时，反应效率则极高。在对比了几种常用的可见光光敏剂后，作者选择了Ir[dF(CF3)ppy]2tBubpyPF6（Ir-F）为最优光敏剂进行后续研究。根据作者的设计，断裂产生的叔丁氧自由基需要进行两种反应：β-均裂（产生甲基自由基）和HAT（产生碳自由基）。这两种过程需要同步进行，并且速率需要匹配，因此作者探索了不同反应条件对两种反应途径速率的影响（图2B）。为此，作者使用Ir-F（1 mol %）为光敏剂、等当量的过氧化物和模板底物、乙腈为反应溶剂（0.3 M），在室温下使用蓝光（395 nm-400 nm）进行照射。结果表明无光照时反应完全不能进行；升高反应温度有利于β-均裂过程；而提高反应浓度有利于HAT过程：当反应浓度由0.15 M提高到0.6 M时，底物转化率由37%提高到74%；溶剂效应表明二氯甲烷会同时降低这两种反应的速率，DMSO抑制了β-均裂过程，2,2,2-三氟乙醇（TFE）则大大提高了β-均裂的反应速率；当把DTBP换成过氧化二异丙苯（DCP）时，也有利于β-均裂过程。
在研究了各种反应条件后，作者探索了过渡金属对该自由基反应的影响。在文献调研基础上，作者选择NiCl2•dme为催化剂、tButpy为配体，在结合各种最优参数后，目标底物的苄位甲基化产率可达60%（图2C），同时也检测到了未反应的原料（20%）和二甲基化产物（18%）。由于甲基自由基活性极高，因此除了参与目标反应外，还可以进行二聚产生乙烷或者作为氢原子转移试剂生成甲烷。为了进一步探索甲基自由基的可能反应途径，作者分析了不同条件下生成的气体产物（图2D）。当无镍催化剂及苄基C-H键底物时，反应会生成大量甲烷气体和少量乙烷；当有镍催化剂但是无苄基C-H键底物时，反应生成了类似量的气体，但是主要成分为乙烷；当镍催化剂和苄基C-H键底物同时存在时，反应生成气体的量大大减少，同时主要成分仍为乙烷。这些结果表明镍催化剂对于目标甲基化产物的生成至关重要。无镍催化剂时，甲基自由基主要参与HAT过程生成甲烷，但是在镍催化剂存在时，甲基自由基则参与偶联反应生成乙烷或者目标产物（图2D）。
图2. 反应条件探索及机理研究。图片来源：Science
在此基础上，作者运用高通量筛选对不同的底物和反应参数进行了评估（图3），并最终确立了四种甲基化反应条件（图3A）。总的来说，对于大部分苄基或者α-氨基C-H键，tButpy为最优配体，DTBP/TFE/TFAH 或者DCP/MeCN/B(OH)3为最优过氧化物、溶剂和酸添加剂组合；对于富电子C-H键底物（如氨基甲酸酯、醚等），三（2-吡啶基甲基）胺（TPA）为最优配体，DTBP/TFE 或者DCP/MeCN为过氧化物、溶剂最优组合；对于活性特别底的底物，可以通过提高浓度来提高转化率。在这四种条件的基础上，作者进一步研究了该甲基化反应的底物适用范围（图3B）。对于含有苄基C-H键的底物，反应可以耐受多种官能团，例如酰亚胺（1）、酯基（2）、烷基及芳基氯（3、4）、一级酰胺（5）、羧基（7）、酮羰基（8）、芳基溴（9）、硼酸酯（10）、Boc保护的胺（11）、磺酸胺（12）以及其它更复杂的底物（13-15）；特别是对于同时含有苯环和吡啶环的底物，甲基化位点仍为苯环苄基位（6）；对于不含苄基但是含有α-氨基C-H键的底物，该反应也具有一定的底物普适性，例如酮羰基（16）、酯基（17-20）、酰亚胺（21）、游离羟基（22）、氟原子（23）及杂环（24-25）取代的底物都能兼容该反应；最后，作者还将该方法用于复杂药物分子（26-30），显示了该方法在药物分子后期官能团化领域的重要应用。需要指出的是，以上反应的产率中等（28%-61%），这也侧面说明了利用甲基自由基实现C(sp3)-H键甲基化的难度之大。
图3。反应优化及底物范围研究。图片来源：Science
在该甲基化反应中，底物在参与偶联反应之前需要被转化为相应的碳自由基，而该过程是由甲基自由基或者氧自由基通过HAT过程实现的。由于该氢原子转移的选择性主要是由底物C-H键的活性决定，所以对于含氮原子的底物，通过改变其电性便可改变反应的位点选择性。比如，在标准反应条件下，Boc保护的胺α位C-H键的反应活性高于酰亚胺保护的氮原子α位C-H键；但是在酸性条件下，Boc保护的胺脱保护后被质子化为铵盐，而胺盐α位C-H键的活性则低于酰亚胺保护的氮原子α位C-H键，从而通过添加酸改变了反应的选择性（图4A）。由于被质子化的胺α位C-H键活性被削弱，所以在同时存在苄基C-H键和氮原子α位C-H键的底物中，可以通过添加酸实现化学选择性的改变（图4B），例如沙芬酰胺（33）、曲美苄胺（34）、西那卡塞（35）和高苯丙氨酸（36）。
图4. 酸诱导选择性的改变。图片来源：Science
在这篇文章中，Shannon S. Stahl教授课题组在镍催化和光驱动的作用下，利用过氧化物为甲基化试剂和氢原子转移试剂实现了C(sp3)-H键的直接甲基化。机理研究表明镍催化剂对于目标C-C键的形成至关重要，同时光敏剂通过三线态能量转移机理活化过氧化物，实现O-O键的均裂进而生成甲基自由基。另外，该反应使用的催化剂简单易得，对水和空气稳定，同时反应条件温和，底物兼容性好。考虑到甲基化反应的重要性，可以预见该方法将会在有机合成及药物研发中获得广泛应用。
C(sp3)-H methylation enabled by peroxide photosensitization and Ni-mediated radical coupling
Aristidis Vasilopoulos, Shane W. Krska, Shannon S. Stahl
Science, 2021, 372, 398-403, DOI: 10.1126/science.abh2623
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