蛋白质定向进化过程中的一个主要挑战是如何重组已经筛选得到的有益突变体，并通过最少的筛选工作得到最佳突变体，进而大幅度改善酶的性能。近日，德国亚琛工业大学团队报告了一种计算机辅助重组规则CompassR，通过分析蛋白折叠的相对自由能变化（ΔΔGfold）来指导有益突变体的重组。使用该规则可以产生不同质量的突变体重组文库，从而指导研究人员快速获得高性能重组突变体。具体的CompassR规则如图1所示：（1）重组位于A类的单点突变体（A类：ΔΔGfold,单点突变< +0.36 kcal/mol），将极大可能获得具有较高酶活和最优性状的重组突变体，该过程可预测性强;（2）重组位于B类（+0.36 kcal/mol < ΔΔGfold,单点突变 < +7.52 kcal/mol）的单点突变体，可能获得较好重组体，也可能获得失活重组体，因此重组后的性状不可预测;（3）重组C类（ΔΔGfold,单点突变> +7.52 kcal/mol）的单点突变体，将极大可能产生失活的重组突变体，从而丧失目标性状。研究人员利用CompassR规则，同时结合定点突变和定点饱和突变大幅度提高了Bacillus subtilis lipase A（BSLA）的离子液体抗性（如图2）。
图1. CompassR重组规则示意图（重组套件一）。图片来源：Chem. Eur. J.
图2. CompassR指导的重组方法用于提高离子液体[BMIM]Cl中的BSLA脂肪酶抗性。图片来源：Green Chem.
虽然CompassR重组规则解决了如何选择可重组的单点突变体候选人的问题，但是可供重组的单点突变体数量仍然不可小觑（通常有10个以上），其理论重组值仍可达到成千上万（例如，10个不同位置的单突变体将产生210=1024种重组体），从而带来繁重的筛选实验。因此，高效的重组策略仍然是亟待解决的问题。为了克服该困难，研究人员又提出了双基因重组策略（2GenReP）和计算引导重组策略（InSiReP)，具体使用过程如图3所示。利用CompassR规则，研究人员选定了15个有益单点BSLA突变株作为重组对象，以有机共溶剂1,4-二氧六烷（1,4-dioxane，DOX）的抗性作为表征信号，对两种重组策略2GenReP和InSiReP进行了应用和比较。研究发现两种策略只需筛选较小的突变文库（~270个突变体），即可获得高抗性的重组突变体。有趣的是，最优突变体（I12R/Y49R/E65H/N98R/K122E/L124K，抗性提升14.6倍）均可在两种策略中获得。因此，两种策略孰优孰劣仍待考察。研究人员建议，在计算资源充足的情况下可使用InSiReP，在具有较好的筛选系统的情况下可使用2GenReP。
图3. 重组策略2GenReP和InSiReP的工作流程图（重组套件二、三）。 图片来源：Chem. Eur. J.
因此，利用重组三件套（CompassR, 2GenReP, InSiReP），并结合通用的定点突变和定点饱和突变技术，蛋白质工程师们可以快速高效的重组有益突变体，获得更优的组合突变体。该三件套作为重要的垫脚石，将进一步推动蛋白质工程和定向进化在各领域的应用。
以上研究内容分别发表在Chemistry - A European Journal（2篇）和Green Chemistry（1篇）上，其中两项工作被评选为杂志Cover Feature和Hot Paper。文章第一作者是亚琛工业大学博士生崔海洋。同时，中科院天津工业生物技术研究所朱蕾蕾研究员、北京化工大学联合培养博士曹浩、浙江大学的联合培养博士蔡海鹰等研究人员的前期实验工作对CompassR规则的发现奠定了坚实基础。这项工作也得到了亚琛工业大学JARA-HPC授予的计算资源的支持。
(1) Computer-assisted recombination (CompassR) teaches us how to recombine beneficial substitutions from directed evolution campaigns. Haiyang Cui, Hao Cao, Haiying Cai, Karl-Erich Jaeger, Mehdi D. Davari and Ulrich Schwaneberg. Chem. Eur. J., 2020, 26, 643-649, DOI: 10.1002/chem.201903994
https://chemistry-europe.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/chem.201903994
(2) CompassR-guided recombination unlocks design principles to stabilize lipases in ILs with minimal experimental efforts. Haiyang Cui, Subrata Pramanik, Karl-Erich Jaeger, Mehdi D. Davari and Ulrich Schwaneberg. Green Chem., 2021, 23, 3474-3486, DOI: 10.1039/D1GC00763G
https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2021/gc/d1gc00763g
(3) CompassR yields highly organic-solvent-tolerant enzymes through recombination of compatible substitutions. Haiyang Cui, Karl-Erich Jaeger, Mehdi D. Davari, Ulrich Schwaneberg. Chem. Eur. J., 2021, 27, 2789-2797, DOI: 10.1002/chem.202004471
https://chemistry-europe.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/chem.202004471
崔海洋博士，2016年硕士毕业于中国科学院大学，其间在中科院天津工业生物技术研究所进行蛋白质晶体学学习（导师，郭瑞庭研究员）。2020年11月在德国亚琛工业大学（RWTH-Aachen University）获得博士学位，师从Prof. Dr. Ulrich Schwaneberg。同年，进入德国DWI莱布尼茨交互材料研究所进行博士后研究。2021年3月赴美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校（University of Illinois at Urbana-Champaign）Prof. Dr. Huimin Zhao （赵惠民）课题组继续进行博士后研究。目前研究领域集中在分子模拟和机器学习指导下的蛋白质工程改造及其在生物催化方面的应用。
Prof. Dr. Ulrich Schwaneberg
Ulrich Schwaneberg教授于1999年在斯图加特大学获得博士学位（导师R. D. Schmid教授，德国）。在美国加州理工学院进行博士后研究后（导师，Frances H. Arnold教授，2018年诺贝尔奖获得者），于2002年在不来梅雅各布斯大学担任教授。2009年，就任亚琛工业大学任生物技术研究所所长，并于2010年同时在DWI-Leibniz莱布尼茨交互材料研究所任职。他是生物经济科学中心的董事会成员，并且是SeSaM Biotech和Aachen Proteineers公司的联合创始人。目前已发表了300多篇文章，申请20多项专利。课题组网站https://www.biotec.rwth-aachen.de/cms/~imne/BIOTEC/
Mehdi D. Davari于Shahid Beheshti University（德黑兰）获得计算物理化学博士学位。之后在德国马克斯•普朗克生物物理化学研究所（哥廷根）从事计算生物分子化学的博士后研究。Mehdi目前是亚琛工业大学生物技术研究所计算生物学部门的负责人。同时，他一直担任HICAST（汉高先进可持续技术创新校园）的协调员，并于2021年4月起在莱布尼茨植物生物化学所任职。目前的研究兴趣集中通过生物分子模拟和人工智能方法阐明蛋白质的结构-动力学-功能关系和蛋白质设计。招生信息见http://muchong.com/t-14602578-1
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