天然产物是动植物、微生物和海洋生物的次级代谢产物，它不仅具有结构及生物活性的多样性和独特性，而且在许多疾病（如癌症、艾滋病、老年痴呆症、疟疾等）的治疗方面都有重要贡献，与人类健康有着密不可分的关系。据报道，自上世纪40年代起，全球应用的175种抗癌药物中有57%直接或间接来源于天然产物。天然产物通常根据其初级代谢物生物合成来源以及参与合成的关键酶家族进行分类，比较常见的天然产物种类，比如萜类化合物、聚酮化合物或非核糖体肽，其生物合成途径也研究的比较多。当然，还有不少天然产物尚需进一步研究。例如，抗癌化合物altemicidin (1) 以及Ile-tRNA合成酶抑制剂SB-203207 (2) 和SB-203208 (3) 都是结构上十分不寻常的天然产物——它们都具有独特的6-氮杂四氢茚满骨架（图1a）。近年来，化学家在Streptomyces sp菌株中识别出1-3的生物合成基因簇（sbz簇），但是sbz簇中剩余的七个功能未表征的基因产物与已知天然产物生物合成途径的典型核心生物合成酶没有显著的同源性（图1b），那么问题来了，这种不寻常的6-氮杂四氢茚满骨架在自然界中究竟是如何组装的呢？
日本东京大学的Takayoshi Awakawa和Ikuro Abe等研究者注意到了生命活动中最重要的辅酶之一、同时也是保健品界热炒的“抗衰老”明星——β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（β-NAD，5，图1a），它可能与上述三种天然产物的6-氮杂四氢茚满骨架有关系吗（图1a结构中的红色部分）？β-NAD不仅是几百种重要代谢酶的辅酶，而且还能作为信号分子参与许多重要的细胞过程，与能量代谢、糖酵解甚至DNA复制等都息息相关，但作为底物参与生物合成的报道好像还不太多。基于系统的探索和发现，他们报道了β-NAD在次级代谢产物生物合成途径中的功能（图1c）。其中，烟酰胺二核苷酸框架被大量装饰，并作为合成新型天然产物的合成砌块。具体而言，S-腺苷甲硫氨酸（SAM，6）和β-NAD（5）在磷酸吡哆醛（PLP）依赖性蛋白SbzP（sbz途径的守门酶）的介导下进行[3+2]环化反应，从而生成含有6-氮杂四氢茚满骨架的二核苷酸产物7，这也是该生物合成途径的关键之处。需要指出的是，作者还在sbzP表达菌株中检测到一种特定的代谢物4，这可能是由于二核苷酸产物7被内源性蛋白在体内降解所致。随后，化合物7经SbzQ介导的C2-羟基化生成中间体8，后者在Gcn5相关的N-乙酰转移酶SbzI作用下成功地转化为9。接着，化合物9在SbzH+SbzN+SbzO的作用下经三步转化为11，后者经F420依赖性还原酶SbzF介导的亚胺还原得到化合物12，最后在SbzE的作用下进行甲基化便可得到所需的Altemicidin (1)。相关成果近日发表在Nature 上。
图1. 利用β-NAD的sbz生物合成途径。图片来源：Nature
如图2所示，作者提出了SbzP介导的[3+2]环化反应的可能机理。首先，静息态的PLP酶（内部醛亚胺）与SAM结合后，通过转醛胺作用形成外部醛亚胺，随后在Cα位去质子化得到醌类物种。接着，醌类物种在Cβ处去质子化以诱导5′-(甲硫基)腺苷（AdoSMe）的消除，从而产生β,γ-不饱和醌类物种，后者不仅具有共轭π-体系，而且在Cγ处具有亲核性，因此能与β-NAD的亲电C4位进行加成以产生中间体I。鉴于中间体I在C5处含有亲核性的二氢吡啶单元，因此作者设想将活性位点赖氨酸残基添加到PLP的C4'位以便通过Cβ处的质子化促进异构化，同时所得的亚胺中间体倾向于在Cα处进行亲核加成并得到中间体II，后者经异构化得到双二胺物种。最后，释放出目标产物并再生内部醛亚胺。
图2. SbzP介导的[3+2]-环化反应的可能反应机制。图片来源：Nature
总体而言，SbzP反应代表了首例PLP介导的串联Cγ和Cα位烷基化，最终导致C4位氨基酸结构单元与β-NAD的吡啶部分发生[3+2]环化反应。需要指出的是，SbzP也属于天冬氨酸氨基转移酶样折叠I型（AAT-I）超家族，并表现出原型的、保守的氨基酸基序，例如：参与PLP辅因子和羧酸盐键合。然而，在系统发育上，SbzP和同源蛋白在进化上与报道的AAT-I亚家族不同，并出现在系统发育树上的一个单独分支上。此外，这种新型β-NAD/SAM利用酶家族在系统发育上也与其它利用SAM的PLP酶无关。SbzP样家族的一个显著特征是存在大约100 个氨基酸长的N-端结构域，并发现它对酶活性至关重要，因为截断会导致酶功能完全消失。
图3. 利用β-NAD的SbzP同系物。图片来源：Nature
作者还将新发现的SbzP样蛋白家族的几个成员在革兰氏阴性和阳性细菌门的各种基因组中进行了生物信息学鉴定。为了研究它们的功能，作者异源表达了八个有代表性的例子，并通过液相色谱-质谱（LC-MS）检查表达菌株的培养物提取物。如图3a所示，通过所有靶向酶的核苷4的积累证实了β-NAD/SAM的利用。对邻近基因区域的分析表明，SbzP同源物被纳入多种孤儿生物合成基因簇，这不同于sbz簇，并含有许多额外的生物合成酶，例如P450单加氧酶、自由基SAM酶、非核糖体肽合成酶、额外的PLP酶以及迄今为止功能未知的几种假想蛋白质（图3b）。
Takayoshi Awakawa和Ikuro Abe等人报道了β-NAD在次级代谢物生物合成途径中的功能，同时确定了一个新的守门酶家族，将初级代谢物β-NAD和SAM引导到次级代谢物的生物合成途径中。该研究不仅扩展了对β-NAD化学生物学的理解，而且为研究β-NAD 衍生的天然产物的生物合成奠定了基础。
β-NAD as a building block in natural product biosynthesis
Lena Barra, Takayoshi Awakawa, Kohei Shirai, Zhijuan Hu, Ghader Bashiri, Ikuro Abe
Nature, 2021, 600, 754–758, DOI: 10.1038/s41586-021-04214-7
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