α-氨基酸是构建生命大厦的“基石”之一，是多肽药物和生物制剂的基础单元，同时，α-氨基酸也是很多小分子药物的关键结构。近年来，同位素标记的α-氨基酸及其衍生物广泛应用于结构和机制生物学、定量蛋白质组学、药代动力学分析、正电子发射断层扫描技术（PET）等多个领域。由于氢同位素标记（2H或3H）易消除或者发生代谢转变，因此α-氨基酸及其衍生物通常采用碳同位素标记。在过去的70多年里，科学家在碳同位素标记的α-氨基酸合成方面也取得了一些进展，其通用策略是将*C标记体引入前体分子，而后经过几步转化来合成目标分子（图1a），例如：1）亲电试剂与*CN-源的取代或加成反应；2）反应前期向*CO2中添加简单的烷基/芳基有机金属试剂；3）使用同位素标记的亲电试剂（如：*CH3I和*C-乙酸盐）进行烷基化；4）手性辅剂控制的不对称合成*C-氨基酸；5）在*C-葡萄糖或*C-乙酸盐存在下生物发酵合成标记的α-氨基酸。此外，11C的短半衰期（t1/2 = 20 min）导致PET所需的氨基酸靶标的多步制备存在问题，而其常用方法仅限于[11C]CN进行氰化/水解反应。另一方面，对于[11C]标记的氨基酸则有不同的策略，例如：1）[11C]蛋氨酸使用[11C]CH3I进行甲基化；2）[11C]谷氨酰胺或谷氨酸可通过[11C-丙烯酸酯]的共轭加成制备。然而，受制于合成步骤、放射化学产率（RCY）以及分离纯化等多方面问题，构建同位素标记的α-氨基酸仍然是一项重大的挑战。
相比之下，CO2是所有同位素标记的碳试剂的主要来源。近年来，科学家利用动态同位素交换原理开发了几种对生物相关化合物进行碳标记的方法，包括：1） Pd催化的酰氯脱羰基化构建同位素标记的羧酸；2）镍催化活性酯的脱羧-羧化生成同位素13C-和14C标记的羧酸；3）热或光化学条件实现电性稳定羧酸的可逆脱羧-羧化来构建同位素碳标记的羧酸。如图1b所示，α-氨基酸在脱羧酶的催化下进行脱羧反应生成二氧化碳和相应的胺类化合物。在此基础上，加拿大阿尔伯塔大学Rylan J. Lundgren和渥太华大学Benjamin H. Rotstein等研究者利用芳醛催化剂和同位素标记*CO2实现了α-氨基酸的羧酸交换反应（图1c），构建了一系列11C、13C或14C同位素标记的α-氨基酸。机理研究表明该反应的关键中间体是亚胺-丙二酸中间体。相关成果于近日发表在Nature Chemistry 上。
图1. α-氨基酸的同位素标记。图片来源：Nat. Chem.
在外加[13C]CO2的体系中，作者以(±)-苯丙氨酸1为模板底物对反应条件进行优化（图2a），结果显示在4-茴香醛（20 mol%）为催化剂、Cs2CO3（40 mol%）为碱、[13C]CO2（~8 equiv.）、DMSO为溶剂的条件下于70℃进行反应，能以75%的13C掺入率和84%的收率得到目标产物(±)-[13C] 1。需要指出的是，4-茴香醛凭借其自身的亲电性成为最佳催化剂，若使用亲电性较强的芳醛催化剂会因竞争性捕获导致收率降低（图2b），而使用亲电性较弱的催化剂（如：磷酸吡哆醛、烷基醛和各种酮等）则导致同位素的掺入率较低。另一方面，对催化剂的亲电性进行深入研究后，发现4-茴香醛反应速率较慢但具有较长的使用寿命，而更具亲电性的4-CF3-苯甲醛或4-CN-苯甲醛初始速率较快但易分解，从而降低13C的掺入率。此外，该反应还可用于引入14C标记，即Ba[14C]CO3原位生成[14C]CO2并在最佳条件下进行反应，可以53%的14C掺入率和51%的收率制备(±)-[14C] 1（图2c）。
图2. 条件筛选。图片来源：Nat. Chem.
在最优条件下，作者考察了多种α-氨基酸的底物范围（图3），结果显示脂肪/芳香族α-蛋白氨基酸（如：(±)-苯丙氨酸（1）、(±)-丙氨酸（2）、(±)-亮氨酸（3）、(±)-甘氨酸（6）、(±)-酪氨酸（7）、(±)-色氨酸（8）、(±)-蛋氨酸（9））、β-支链取代的α-蛋白氨基酸（如：(±)-异亮氨酸（4）、(±)-缬氨酸（5）、(±)-脯氨酸（10））甚至带有酸性/碱性侧链的α-蛋白氨基酸（12-14、15-17）均能兼容该反应，以中等至较好的收率和掺入率获得相应的13C标记产物，尽管4、5、10的掺入率较低。另外，不同基团（如：卤素原子（21-23）、叠氮化物（24）、硝基（25）和硼酸（26））取代的苯丙氨酸以及其它芳基/烷基取代的α-氨基酸（27-37）同样能进行同位素标记。值得一提的是，作者还通过目前建立的方法获得了同位素标记的手性α-氨基酸，例如：1）胰凝乳蛋白酶催化的酯水解可以99% e.e.值获得13C标记的 L-苯丙氨酸1a（总收率：26%，13C掺入率：86%）；2）酰化酶催化N-乙酰亮氨酸的水解可以>99% e.e.值制备L-亮氨酸3a（总收率：38%，13C掺入率：38%）；3）镍介导的动态动力学拆分可以>50%的收率获得相应产物——L-苯丙氨酸1a（总收率：70%，13C掺入率：63%，e.e.值：97%）和 L-蛋氨酸9a（总收率：54%，13C掺入率：58%，e.e.值：94%）；4）色谱分离也可轻松获得(±)-Fmoc-Phe衍生物L-1b（总收率：24%，13C掺入率：87%，e.e.值：96%）。
图3. 底物拓展。图片来源：Nat. Chem.
接下来，作者通过改变反应条件来实现α-氨基酸的11C标记。由于11C的半衰期仅为20 min，因此需要事先生成亚胺羧酸盐以进行后续的11C同位素标记。如图4a所示，作者将α-氨基酸与不同的芳醛进行缩合得到相应的亚胺羧酸盐，后者与[13C]CO2（3 equiv.）反应30 min后，发现苯甲醛衍生的亚胺效果最好（13C掺入率：33%），并且在90℃进行反应可提高到62%。基于上述条件，作者以24%的RCY制备(±)-[11C] 1，并且羧酸亚胺盐的反应性优于醛（图4b）。需要指出的是，(±)-酪氨酸（7）、(±)-色氨酸（8）、(±)-亮氨酸（3）、(±)-蛋氨酸（9）、(±)-赖氨酸（13）、(±)-谷氨酰胺（14）、(±)-甲状腺素（27）和谷胱甘肽（32）均能成功地得到相应的11C标记产物（图4c）。此外，该方法获得的(±)-[11C] 1的摩尔活性为8.4 GBq mmol-1，并可用于PET进行氨基酸体内示踪研究。
图4. 醛催化α-氨基酸与[11C] CO2的羧酸交换反应。图片来源：Nat. Chem.
起初，作者认为羧酸盐交换机制可能是经亚氨基-烯醇或亚氨基-dienolate中间体（图5a，i-1→1）的羧化、再脱羧进行的，并非是最初脱羧形成的氮杂烯丙基阴离子中间体i-3捕获CO2的机制。为了探究反应机理，作者进行了一系列实验，结果表明：1）在标准条件下加入氘水的实验表明氮杂烯丙基阴离子不是反应过程中形成的中间体（图5a）；2）对照实验表明α-氨基酸原位脱羧生成的胺不能通过羧化作用再次进行交换（图5b）；3）丙酮催化羧酸盐交换反应时产物1的13C掺入率为14%，而非烯醇化的α-氨基酸（2-氨基异丁酸39）却无法实现交换反应，尽管后者能通过亚胺i-4的脱羧作用形成苄基稳定的氮杂烯丙基阴离子（图5c）；4）4-溴苯丙氨酸和苯乙醛在标准条件下进行反应时获得的13C标记产物22，进一步支持了丙二酸中间体i-6的形成（图5d）。此外，在进行羧酸交换反应时，在不同醛负载量下没有观察到相应的芳基甘氨酸区域异构体，这进一步表明没有生成氮杂烯丙基中间体（如：i-3）。
图5. 机理研究。图片来源：Nat. Chem.
在此基础上，作者提出了可能的反应机理（图6）。首先，醛与α-氨基酸缩合形成亚胺中间体，随后通过去质子化/互变异构形成亚胺羧酸盐亲核试剂，后者与溶解的*CO2进行可逆的羧化反应并形成亚氨基-丙二酸中间体，接着经单脱羧反应生成亚氨基-二烯醇中间体，该中间体能够可逆生成亚胺中间体，最后经水解便可生成所需的*C标记产物，同时再生醛催化剂。需要指出的是，催化循环中的所有步骤都是可逆的，这也意味着*CO2的掺入是由热力学控制的。
图6. 反应机理。图片来源：Nat. Chem.
总结
本文在温和条件下利用醛催化剂和同位素标记*CO2实现了α-氨基酸的羧酸交换反应，构建了一系列11C、13C或14C同位素标记的α-氨基酸。该方法不仅条件温和、底物耐受性好，而且对于同位素标记的α-氨基酸的构建以及药物开发和医学成像等方面具有重要的意义。
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Aldehyde-catalysed carboxylate exchange in α-amino acids with isotopically labelled CO2
Odey Bsharat, Michael G. J. Doyle, Maxime Munch, Braeden A. Mair, Christopher J. C. Cooze, Volker Derdau, Armin Bauer, Duanyang Kong, Benjamin H. Rotstein, Rylan J. Lundgren
Nat. Chem., 2022, DOI: 10.1038/s41557-022-01074-0
（本文由吡哆醛供稿）
