Nature：卡宾转移化学的“新战场”- 大数跨境

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2023-06-25

导读：美国劳伦斯伯克利国家实验室的Aindrila Mukhopadhyay和Jay D. Keasling等证明了天然α-重氮酯丝氨酸可以由生物合成基因簇改造的Streptomyces albus 菌株生

生物合成是一种环境友好且可再生的方法，可用于合成许多天然产物，并且在某些情况下还可以生成“新天然（new-to-nature）”产物。然而，与合成化学不同，生物合成领域并没有那么多可用的反应，能生产的产品范围要窄得多。其中一个重要的例子，就是卡宾转移反应。尽管此前研究已经提出了一些涉及卡宾中间体的天然酶促转化，但将其用于非天然生物合成却极具挑战性。近年来，金属酶被用于催化许多非生物卡宾转移反应（图1a），例如：烯烃的环丙烷化、卡宾单元插入N-H和C-H键，并且这些酶表现出优良的非天然活性和选择性。然而，作为卡宾前体的重氮化合物和金属辅助因子需要从外部添加到细胞中，这极大地阻碍了高性价比的工艺放大。可以想见，在细胞内合成卡宾前体以及工程化酶催化剂将会解决这些问题，并大大扩展酶促非天然卡宾转移反应的应用（图1b）。

近日，美国劳伦斯伯克利国家实验室的Aindrila Mukhopadhyay和Jay D. Keasling以及加州大学伯克利分校的John F. Hartwig和Douglas S. Clark等研究者合作在Nature 上发表高水平文章，证明了天然α-重氮酯丝氨酸可以由生物合成基因簇改造的Streptomyces albus 菌株生成，并作为卡宾前体与细胞内产生的苯乙烯进行偶联反应以产生含有环丙基的非天然氨基酸。毫无疑问，这项研究为将这些卡宾转移反应完全整合到生物合成中奠定了基础，并拓宽了细胞代谢生产化学物质的范围和结构多样性。

图1. 生物合成中的卡宾转移反应。图片来源：Nature

重氮化合物（如：重氮乙酸乙酯（EDA））是金属-卡宾配合物的常见前体。由于有些天然产物含有重氮基团，因此作者认为这些天然产物可以用作生物合成的卡宾前体（图2a），特别是重氮丝氨酸（最初被确定为治疗癌症的药物）的大小和电性与EDA相似，这意味着它可能是细胞内卡宾转移反应的合适试剂。为此，作者在由人工辅因子Ir(Me)MPIX和血红素催化的苯乙烯环丙烷化反应中探究了重氮丝氨酸作为卡宾前体的能力（图2b），同时使用LC-HRMS分析反应产物并与独立合成的真实产物进行比较，结果显示该反应能够生成环丙烷化产物，这表明重氮丝氨酸可以作为卡宾前体。随后，作者探索了它的生物合成途径，发现重氮丝氨酸对白色链球菌（S. albus）的生长没有抑制作用，因此选择S. albus 作为宿主。接着，将预测的基因簇进行克隆并整合到S. albus 的染色体中，蛋白质组学分析表明在克隆区域编码的23种蛋白质中有20种得到表达。在测试条件下，重氮丝氨酸由工程化的S. albus 菌株生物合成，为预测的基因簇提供了功能验证（图2c）。在优化的培养条件下，当细胞在培养基中生长48 h时，滴度达到103 mg l^-1（图2d）。即使去除细胞后，重氮丝氨酸的滴度会随着胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）培养基中培养时间的延长而降低，这可能是由于重氮丝氨酸与细胞在TSB培养基中培养时产生的成分发生了反应。

图2. 卡宾前体重氮丝氨酸的异源生物合成。图片来源：Nature

为了将非生物卡宾转移反应整合到生物合成中，需要一种工程化酶能以重氮丝氨酸为卡宾前体。对于苯乙烯与重氮丝氨酸的反应，作者筛选了先前报道通过卡宾转移催化环丙烷化的几种P450及其突变体的活性，结果显示与表达红色荧光蛋白（RFP）的对照实验相比，表达野生型（WT）P450-T2和CYP119突变体的大肠杆菌细胞表现出显著的活性和不同的非对映选择性（图3a）。尽管由含有 P450-T2的全细胞催化反应的非对映选择性为87.8%，但由纯化的蛋白质催化反应时则可高达99.3%（图3c），这可能是由于全细胞内游离血红素的干扰所致。此外，作者还探索了来自沼泽红假单胞菌的CYP203A1（P450-T2的同源物）及其突变体催化苯乙烯与重氮丝氨酸反应的效果，结果显示CYP203A1及其突变体的活性低于P450-T2 WT，因此作者选择 P450-T2 WT进行工程化设计。

为了指导定向进化，作者确定了P450-T2的晶体结构（图3b）。在结构和先前研究的基础上，作者选择血红素结合口袋周围和特定环区域上的几个位点进行位点饱和诱变并评估其活性和选择性，结果显示第一轮突变体（S239V）催化反应形成的产物量是WT酶形成量的46倍（图3c），第三轮突变体（S239V，F338H）的活性大约是S239V突变体的五倍，而第五轮突变体（P450-T2-5）则能以高非对映选择性（dr>99%）和中等产率（42.7%）催化该反应，并且该产率比WT酶催化的反应产率高251倍。此外，P450-T2 WT和P450-T2-5还能催化重氮丝氨酸的卡宾单元插入苯并四氢呋喃的sp³ C-H键（图3d），其中WT酶能以高非对映选择性催化反应（dr=97.2%），而P450-T2-5的活性要比WT高220倍并且非对映选择性优良（dr=85.8%），尽管产率略低于WT。

图3.工程化细胞色素P450催化重氮丝氨酸为卡宾前体的卡宾转移反应。图片来源：Nature

接下来，作者尝试通过生物合成来产生反应底物苯乙烯，即通过将所需基因整合到基因组中，在产生重氮丝氨酸的S. albus 菌株中重建了苯乙烯的生物合成途径（图4a），该途径由两种将苯丙氨酸转化为苯乙烯的酶组成——苯丙氨酸解氨酶和阿魏酸脱羧酶（FDC）。尽管先前报道称合成FDC的辅因子需要异戊二烯转移酶，但本文中FDC活性不需要额外的异戊二烯转移酶基因，这可能是由于异戊二烯转移酶的同系物是在S. albus 中自然表达。鉴于苯乙烯易挥发，因此它的生产是在封管中进行的，后者具有足够的顶部空间来提供生长S. albus 所需的氧气（图4b）。在工程化S. albus 以产生苯乙烯与重氮丝氨酸环丙烷化的两种底物和进化细胞色素 P450-T2以增加反应活性后，进化的P450-T2-5突变体被整合到产生重氮丝氨酸和苯乙烯的S. albus 菌株基因组中以构建最终菌株，后者可以生物合成地产生反应的所有成分。然后，作者培养最终菌株以测试非天然环丙烷是否会通过预期的生物合成产生。在含有4 mM苯丙氨酸的培养基中培养菌株72 h后，通过LC-HRMS和LC-MS/MS检测并确认非天然环丙烷（图4c），时间进程的结果表明在当前条件下72 h后滴度不再增加。为此，作者对不同的培养基进行了测试，并将P450-T2-5基因的另一个拷贝整合到染色体中以提高滴度，最终以95%的dr值形成了222 µg l^-1的环丙烷产物（图4d）。总而言之，工程化S. albus 菌株能够生物合成用于非生物卡宾转移反应的所有反应组分并产生非天然产物，而无需外源添加的卡宾前体和催化剂。

图4. 通过非生物卡宾转移反应生物合成非天然环丙烷。图片来源：Nature

总结

本文研究团队通过在细胞内生产卡宾前体（如：重氮丝氨酸）将非生物卡宾转移反应引入微生物代谢，表明此种反应可以完全整合入生物合成中。由于卡宾转移反应中的所有成分都由微生物产生，因此该体系在工业上的规模化将更容易实现且成本更低。此外，还可以将重氮丝氨酸作为非经典氨基酸引入蛋白质中，然后对所得蛋白质进行卡宾转移反应，或者在将重氮丝氨酸引入蛋白质之前进行卡宾转移反应，这两种方法都可以产生含有非天然氨基酸的蛋白质，进一步拓宽了该策略的适用范围。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：

Complete integration of carbene-transfer chemistry into biosynthesis

Jing Huang, Andrew Quest, Pablo Cruz-Morales, Kai Deng, Jose Henrique Pereira, Devon Van Cura, Ramu Kakumanu, Edward E. K. Baidoo, Qingyun Dan, Yan Chen, Christopher J. Petzold, Trent R. Northen, Paul D. Adams, Douglas S. Clark, Emily P. Balskus, John F. Hartwig, Aindrila Mukhopadhyay, Jay D. Keasling

Nature, 2023, 617, 403-408, DOI: 10.1038/s41586-023-06027-2