Nature：自由基化学中的“手性记忆”- 大数跨境

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2024-10-31

导读：近期，意大利博洛尼亚大学的Paolo Melchiorre教授课题组基于酶键合催化中间体激发而非辅因子激发策略（图1c），成功地实现了非天然光脱羧酶催化的立体特异性自由基偶联反应。

副标题：非天然光脱羧酶催化的立体特异性自由基偶联反应

在过去的几十年里，自由基介导的转化已成为合成化学的强有力工具，但是手性自由基固有的构型不稳定性和快速外消旋化使其难以控制两个立体中心的立体选择性（图1a）。尽管大多数烷基自由基的结构是金字塔形，但其通过sp²杂化形成伞型的转化能垒非常低。这种构型的不稳定性会导致手性自由基前体参与的不对称策略变得无效，主要原因在于手性自由基前体在生成自由基中间体后会导致立体化学信息消失。目前，化学家已经报道了许多手性自由基前体合成外消旋产物的自由基过程。另一方面，酶凭借其可变的活性位点、相互作用以及空腔等优势为手性自由基前体构建手性产物提供了一种新策略，例如，光酶利用光能实现自由基的合成转化。除了DNA光解酶和原叶绿素还原酶外，最近科学家还发现了一种能将脂肪酸转化为非手性烷烃的脂肪酸光脱羧酶（FAP，图1b左），主要是通过黄素辅因子的激发驱动来实现羧酸的自由基氧化脱羧过程。此外，还有一些生物过程利用酶键合亚胺离子中间体，例如天然I类醛缩酶利用赖氨酸（Lys）的ε-氨基与羰基底物形成共价烯胺和亚胺离子中间体来催化反应（图1b，中），而在小分子催化中亚胺离子经光激发可实现热催化无法实现的转化（图1b，右）。

近期，意大利博洛尼亚大学的Paolo Melchiorre教授课题组基于酶键合催化中间体激发而非辅因子激发策略（图1c），成功地实现了非天然光脱羧酶催化的立体特异性自由基偶联反应。具体来说，首先工程化I类醛缩酶活性位点内的氨基与烯醛1进行反应并产生瞬态亚胺离子，该离子可以吸收紫光并起到单电子氧化剂的作用，驱动手性羧酸发生SET氧化、脱羧并产生相应的手性自由基III，III与β-烯胺基自由基II进行立体特异性交叉偶联便可生成两种立体中心产物。值得注意的是，该策略以对映纯手性底物作为原料，可选择性地以完全对映选择性控制获得所需的非对映异构体产物，进而有效地解决了手性自由基快速外消旋化这一长期问题。总体来看，该策略实现的“手性记忆”效果在对映选择性自由基化学中是比较罕见的。相关成果发表在Nature 上。

图1. 分子间自由基过程控制两个立体中心的生物催化策略。图片来源：Nature

首先，作者选择肉桂醛1a和2-苯乙酸2a为模板底物对光脱羧酶进行了研究（图2a），结果显示在紫光照射下天然2-脱氧-D-核糖-5-磷酸I类醛缩酶的工程化变体DERA-MA能以33%的转化率和>99% ee值获得产物3a，同时对照实验表明酶和光照至关重要，缺一不可。如图2b所示，作者利用计算模型和分子对接研究了光酶反应性的提高以及活性位点内的关键氨基酸，发现DERA-MA活性位点内的两个丝氨酸残基通过氢键实现稳定作用，同时亚胺离子的芳基和2a之间的额外π-π堆积相互作用进一步将底物牢固定位在附近。基于此，作者试图用更疏水的丙氨酸残基替换它们以分析每个丝氨酸对反应性的影响，结果显示工程化变体DERA-MA^S18A（2a更接近亚胺离子）的转化率明显高于亲本酶，DERA-MA^S238A则大大阻碍了反应性，而双突变体 DERA-MA^S18A/S238A显著降低了3a的转化率，进而突出了S238对催化活性的重要性。值得一提的是，DERA-MA^K167L变体（将赖氨酸替换为亮氨酸）完全无活性，进而强调了K167在活化1a和形成亚胺离子方面的关键作用。其次，作者使用DERA-MA^S18A 进行了进一步研究，UV/Vis光谱分析表明向酶中加入烯醛1a会形成一种吸收波长约为400 nm的新中间体并将其归因于亚胺离子（图2c，上），而且添加2a不会引起吸光度的显著变化，进而排除了任何基态聚集体的形成，这一结果与酶键合亚胺离子直接被激发并观察到反应性的假设相一致。另外，作者发现反应在暴露于紫光后开始，在转为黑暗后立即停止（图2c，下），进而表明工程化DERA醛缩酶可用作光脱羧酶。在最优条件下，作者对光生物催化过程的底物兼容性进行了研究（图2d），结果显示苯环上带有不同取代基的羧酸衍生物（3a-3h）、杂芳基羧酸（3i和3j）以及多种烯醛衍生物（3k-3m）均能以中等至良好的转化率和优异的对映选择性获得相应产物，并且作者发现DERA-MA^S18A适合活化对位取代的羧酸，而母本DERA-MA变体则更倾向于其它取代模式（如：产物 3c和3d）。

图2. 初步探索和机理研究。图片来源：Nature

接下来，作者尝试以1a和rac-4a为模型底物来构建两个立体中心（图3a），结果显示DERA-MA能以99% ee值和1.1:1 dr值获得单一的对映体5a，而使用手性自由基前体4a的两个对映体进行相同反应时则获得了5a的两个非对映异构体。类似地，DERA-MA^S18A能够有效催化这一过程，其中(R)-4a能以36%的转化率、4:1 dr和99% ee值产生 syn-5a，而(S)-4a则以11%的转化率、4.5:1 dr值和99% ee值产生anti-5a，这些结果说明光脱羧酶能够将4a的立体化学信息转移到产物5a，从而获得syn和anti-非对映异构体，并且(R)-4a比(S)-4a更具活性。如图3b所示，(R)-4a与S238通过氢键相互作用而稳定，使得α-甲基固定在由丙氨酸残基（S18A）形成的疏水腔内，同时α-甲基碳上的氢原子指向苏氨酸残基T203。基于此，作者对该特定位点进行诱变以增强(S)-4a的结合亲和力，结果显示双突变体DERA-MA^S18A/T203A的反应性和立体选择性均有所提高，分别以38%和62%的转化率获得相应的anti-5a（15:1 dr）和syn-5a（7.5:1 dr），而且计算模型揭示了T203A中新形成的疏水空腔可有效地容纳(S)-4a的α-甲基（图3b，右）。随后，作者通过定向进化来提高DERA-MA^S18A/T203A的催化活性，发现低活性底物(S)-4a的最佳变体是DERA-MA^{S18A/T203A/G239A}，其能显著提高非对映选择性（21.5:1 dr）和TON（18 vs 6），并且该变体对(R)-4a（TON=17 vs 10）也表现出更高的活性并保持与原始酶相似的立体化学结果，而DERA- MA^{S18A/S52G/T203A}变体显示出显著增强的活性和非对映选择性。

图3. 立体特异性自由基偶联、酶工程和机理研究。图片来源：Nature

X-射线衍射分析为syn-5产物的相对构型和绝对构型提供了明确的证据，进而表明自由基过程是随着羧酸4立体中心构型的完全翻转而进行的。如图3c所示，作者认为在(R)-4a键合中亚胺离子与羧酸之间的特定π-π相互作用以及与S238的选择性氢键相互作用促进了活性位点内两个底物的紧密靠近。然后，亚胺离子I*激发引发4a的SET氧化并导致脱羧和手性苄基自由基III的形成，而且III的立体化学完整性是通过特定的相互作用来维持，包括A18形成的疏水口袋稳定了α-甲基。总之，这种弱相互作用促进了III与手性5π-烯胺基自由基II之间的距离驱动的立体特异性自由基偶联反应，并且该反应速率比手性自由基的外消旋化更快。此外，作者对光脱羧酶活化链烯酸6的反应性进行了研究（图3d），并以19%的转化率和优异的对映选择性获得手性γ-内酯7。

如图4a所示，作者利用工程化变体DERA-MA^S18A/T203A（10 mol%）对光酶催化自由基过程的底物范围进行了考察，结果显示一系列不同基团取代的手性羧酸4以及烯醛1均能兼容该反应，以中等至良好的产率、非对映选择性和优异的对映选择性获得相应的syn-5和anti-5产物，其中化合物syn-5k和syn-5e衍生物能通过X-射线衍射分析来确定产物的绝对构型和相对构型。最后，作者试图修饰活性位点以改变酶的反应性（图4b），具体而言：在203位点引入比丙氨酸更大的残基可能会选择性地阻碍容纳(S)-4中α-甲基基团的疏水腔，同时(R)-4仍然能够适应A18提供的腔体，这样就可以实现酶促外消旋羧酸4的动力学拆分（KR）。事实上，对203位点的各种空间要求较高的氨基酸进行筛选后，作者发现DERA-MA^S18A/T203^V变体能够有效催化1a和rac-4a的反应并以良好的立体选择性（5.3:1 dr、99% ee）获得产物syn-5a。值得一提的是，使用手性底物4a进行的实验证实了KR过程：其中(R)-4a以高反应性和立体控制获得产物syn-5a，而(S)-4a的反应非常缓慢，尽管立体特异性得以保持。类似地，其它外消旋羧酸同样可以参与KR反应并生成相应产物syn-5b-c。

图4. 底物拓展。图片来源：Nature

总结

Paolo Melchiorre教授课题基于酶键合催化中间体激发而非辅因子激发策略策略，成功地实现了非天然光脱羧酶催化的立体特异性自由基偶联反应，并以中等至良好的产率和优异的对映选择性获得相应产物。值得注意的是，该策略以手性自由基前体作为原料，可选择性地以完全对映选择性控制获得所需的非对映异构体产物，进而有效地解决了手性自由基快速外消旋化的长期问题。这种“手性记忆”效果在对映选择性自由基化学中是比较罕见的。

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