CRISPR-Cas12a系统因其高特异性和高效切割活性，已成为分子诊断领域的重要工具。然而，其在检测非核酸靶标（如酶、蛋白质等）时，通常需要多步识别和转化过程将靶标转化为核酸模拟靶标，过程复杂、成本高且耗时。近日，西南大学化学化工学院卓颖教授团队在Angewandte Chemie 上发表热点研究论文（Hot Paper），提出了一种通过邻近间隔区基序（PAM）拓扑工程策略，实现了对Cas12a活性的精准调控，并成功用于多种核酸酶的直接、快速检测。
具体而言，该研究团队通过将PAM序列分裂并嵌入三叉连接中心，设计了一种含有Cas12a激活子序列的Y形DNA结构（Y-COPE）。这种精心设计的拓扑结构有效阻断Cas12a对PAM的识别，从而抑制其活性。当目标核酸酶识别切割特定位点后，释放DNA片段并动态修复PAM的双链结构，从而激活Cas12a并触发信号输出。
首先，通过合理设计一系列Y-COPE变体（Y1–Y6），逐步将PAM（5′-TTTA-3′）从分支远端移至茎部近端，研究发现Y3变体对Cas12a的抑制效果最强。凝胶电泳（PAGE）和荧光分析结果高度相关（Pearson’s r = 0.9279），证实PAM拓扑结构对Cas12a活性具有可靠有效的调控作用。
通过结构建模和理论结合能分析计算发现，Y-COPE与Cas12a RNP的结合自由能比经典dsDNA激活子高24.2 kcal/mol，且PAM与Cas12a蛋白PI结构域中关键残基Lys595之间的中心距离增加了1.8 Å，从机制上揭示了PAM拓扑结构抑制Cas12a活性的作用机制。
最后，作为概念验证，该团队成功构建了用于尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）和核糖核酸酶H（RNase H）检测的功能化Y-COPE变体。UDG检测限达2.69×10–5 U/μL，RNase H检测限低至2.55×10–7U/μL，且在复杂生物基质中检测性能优良，显示出高的特异性和抗干扰能力。
这一成果近期发表在Angewandte Chemie International Edition 上。西南大学为第一完成单位，西南大学化学化工学院卓颖教授为该论文独立通讯作者，西南大学化学化工学院陶秀丽博士为该论文第一作者。合作者为吉林大学化学学院宋大千教授和马品一高级工程师。作者特别感谢国家自然科学基金、中央高校基本科研业务费、发光分析与分子传感教育部重点实验室的大力支持。
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Allosteric Activation of Cas12a via PAM Topological Engineering for Direct and Rapid Detection of Nucleases
Xiu-Li Tao, Yan-Mei Lei, Xue-Mei Zhou, Zhao-Peng Chen, Yue Ma, Pin-Yi Ma, Da-Qian Song, Ying Zhuo
Angew. Chem. Int. Ed., 2025, DOI: 10.1002/anie.202515521
导师介绍
卓颖，国家优秀青年基金获得者、教授、博士生导师。2003-2009年在西南大学分别获得分析化学硕士和博士学位；2009年至今在西南大学化学化工学院工作。围绕生物体内生化信息的高效获取这一关键科学问题，通过设计功能化的核酸分子机器，构建了一系列生物传感新技术与新方法。2019年入选重庆市英才计划首批“青年拔尖人才”；2020年获国家自然科学基金优秀青年基金资助，2024年入选第四批重庆市学术技术带头人。相关成果以第一作者和通讯作者在Angew. Chem. Int. Edit., J. Am. Chem. Soc., Sci. Adv., Adv. Sci., Chem. Sci.和Anal. Chem.等国际重要学术期刊发表研究论文126篇，论文总引用次数超过11,000次（Web of Science），H指数64。部分研究成果《高灵敏电致化学发光肿瘤标志物microRNA生物传感器》获重庆市自然科学一等奖（2021年，排名第三）。担任发光分析与分子传感教育部重点实验室副主任，西南大学科学技术协会委员会副主席。受邀担任美国化学会《Analytical Chemistry》编辑顾问委员（Editorial Advisory Board）、学术期刊Chinese Chemical Letters编委；入选2023全球前2%顶尖科学家榜单之“终生科学影响力榜单”。
https://www.x-mol.com/university/faculty/13990
