DNA常以经典的B型右手双螺旋形象示人，静静承载着遗传信息的密码。除了作为遗传信息的载体，DNA分子还能够折叠、弯曲、缠绕，构筑出精妙绝伦的三维结构，实现靶标结合、底物催化等多样性功能。作为功能核酸的重要代表，DNA适体凭借特定三维结构识别蛋白质或小分子靶标，被广泛应用于各个领域。然而，解码DNA适体的秘密并不容易：相较于RNA，它天生的折叠能力稍显“内敛”，而现有计算方法又难以准确预测DNA与配体的结合方式。这引出一个耐人寻味的问题：DNA适体是如何利用原子级的构象密码，完成与靶标的精准识别？回答这一问题，不仅有助于阐明其识别机制与设计原则，也将丰富我们对DNA构象多样性与功能关系的认知。
ATP被誉为细胞活动中的“能量货币”，同时也是核酸适体筛选的重要模式靶标之一。在ATP适体的研究史上，有两位经典代表：一是27-nt 的DNA适体（KD ~ 6 µM），结合两分子ATP；二是40-nt的RNA适体 (KD ~ 0.7 µM)，结合一分子ATP，它们与AMP（而非 ATP）的复合物结构已被解析。2023年，刘珏文教授团队报道了一个40-nt的DNA适体1301b，结合一分子ATP，KD ~ 2.5 µM（JACS, 2023, 145, 7540，点击阅读详细）。相较于经典的ATP RNA适体，ATP DNA适体亲和力稍差，但凭借其良好的化学稳定性和高度的可编程性，在实际应用中展现出更广阔的前景。然而，目前DNA适体-ATP复合物三维结构信息的缺乏，导致我们对其识别机制和功能优化的探索仍停留在未知的边缘。
近日，中国科学院杭州医学研究所谭蔚泓院士/韩达研究员/郭沛副研究员团队利用液体核磁共振（NMR）技术解析了DNA适体-ATP 1:1 复合物的三维结构，揭示了其精巧的“L”型折叠和对ATP的动态识别机制，并基于此设计了一种对ATP具有亚微摩尔KD（~0.7 μM）的优化体。该工作发表在PNAS 上。
首先，作者基于热力学稳定性和DNA结构分析，对野生型序列进行截短，并利用ITC实验验证截短后的34-nt适体1301b_v1结合一分子ATP，且亲和力稍有改善（KD = 1.9 ± 0.1 μM，图1A）。接下来，作者向1301b_v1滴定ATP并分析1D 1H NMR谱图中的亚氨基质子（G H1和T H3）信号。值得注意的是，在没有ATP存在时，DNA适体仅能形成少数碱基配对；当存在≥1当量ATP时，DNA适体形成12个稳定的Watson-Crick碱基配对（图1B）。这表明DNA适体通过适应性结合（adaptive binding）机制识别ATP，并与ATP形成稳定的1:1复合物。最后，作者利用二维核磁谱图中提取的293对原子间距离约束和若干角度约束，结合约束型分子动力学（rMD）测定了1301b_v1-ATP复合物的高分辨率三维结构（图1C-F）。有趣的是，该DNA适体形成精巧的“L”型折叠，与经典RNA适体的“L”型折叠极为相似，证明了DNA亦具有形成复杂高级结构的能力。
图1. 1301b_v1-ATP复合物的溶液核磁结构（PDB ID: 9KTJ）。图片来源：Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
1301b_v1-ATP复合物结构包括P1配对区（核苷酸#1-4和#31-34）、P2配对区（核苷酸#16-26）、两个内部环区J1/2（核苷酸#5-15）和J2/1（核苷酸#27-30）。其中，两个内部环存在一个显著特征：T7∙A29 与 T8∙A28 分别形成了 Watson-Crick 碱基对（图2A-B），这由T7 H3-A29 H2 和 T8 H3-A28 H2的 NOE数据支持。T7∙A29 还与 T8∙A28 形成碱基堆积，且T7 和 T8 分别与 G30 形成了额外的氢键（图2C）。同时，G5分别和C10、G11形成氢键，T13分别和G9、G11形成氢键（图2D-E）。此外，A15、G27和C26构成连续的碱基堆积（图2F）。
图2. 复合物中DNA适体内部环区的稳定作用力。图片来源：Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
ATP的结合口袋定位于T8∙A28碱基对与G9至G14之间（图3A）。具体而言，ATP的碱基插入T8∙A28和G9之间形成碱基堆积作用（图3B-C），并与G14和G30形成氢键（图3D）；ATP的糖环与磷酸基团则朝向口袋外侧。为了评估这些碱基的重要性，作者对DNA适体进行了定点突变实验（图3E）。ITC结果显示，与ATP直接作用的T8∙A28、G9、G14以及G30的碱基突变都会导致结合能力的丧失，进一步验证了这些碱基的重要性。另外，尽管 T7∙A29 和 T13 不直接与 ATP 相互作用，但它们分别参与了和T8∙A28的堆积作用、G9的氢键作用（图2C、2E），所以它们的突变也都导致结合能力的丧失。作者将1301b_v1-ATP复合物的结合口袋与已报道的经典DNA适体-AMP复合物、经典RNA适体-AMP复合物结构进行比较（图3F-H），发现了一个有趣的现象：尽管这些复合物的结合口袋存在一定差异，但它们识别ATP或AMP及其衍生物主要是通过与对面的鸟嘌呤形成氢键，并被相邻碱基的堆积作用来协助稳定于结合口袋中。
图3. DNA适体-ATP复合物结合口袋特征与识别机制。图片来源：Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
图4. Mg2+诱导DNA适体折叠并促进ATP的结合。图片来源：Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
最后，作者对1301b_v1 DNA适体进行优化改造以提升对ATP的亲和力，降低对Mg2+的依赖性。定点突变结果表明，构成结合口袋的核苷酸的碱基不耐受突变（图3E）。因此，作者将优化策略铆钉在了糖环修饰上。2'-O-Me被报道可以稳定凸起和环等动态构象，于是作者选择了对动态性较高的中心连接处的核苷酸进行2'-O-Me修饰（图5A）。最终发现9/10/16的2'-O-Me修饰达到了亚微摩尔级KD（0.7 ± 0.1 μM），并显著降低了Mg2+依赖性（图5B-C）。此外，作者也进一步验证了9/10/16OMe同样通过适应性结合（adaptive binding）机制识别ATP（图5D）。
图5. 基于结构-功能关系指导的DNA适体功能优化。图片来源：Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
本工作首次呈现了DNA适体-ATP 1:1复合物的三维结构，不仅揭示了它巧妙的“L”型折叠与适应性识别机制，还借助结构信息与定点突变实验建立了清晰的“结构—功能”关联，并基于此设计出以亚微摩尔KD 结合ATP的优化适体。值得一提的是，该团队于2024年7月报道了靶向PTK7蛋白的DNA适体sgc8c的复杂三通结构（PNAS, 2024, 121, e2404060121, 点击阅读详细），这些发现证明了DNA结构和功能的多样性，拓宽了功能DNA分子的设计思路。
上述成果近期发表于Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.。江言为第一作者，谭蔚泓院士、韩达研究员、郭沛副研究员为通讯作者。
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Structural basis and affinity improvement for an ATP-binding DNA aptamer
Yan Jiang, Yuchao Zhang, Liqi Wan, Cheng Cui, Pei Guo, Da Han, Weihong Tan
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2025, 122, e2506491122, DOI: 10.1073/pnas.2506491122
