与需要手术或穿刺获取组织的传统活检相比，液体活检仅需抽取少量血液即可检测肿瘤释放的循环游离DNA（cfDNA），具有无创、可重复动态监测、能克服肿瘤异质性等优势，已成为精准医疗的重要工具。然而，液体活检技术的临床应用仍面临挑战：血液中绝大多数cfDNA来自正常细胞，肿瘤来源的DNA往往只占极低比例（可低至0.01%），传统检测方法如同“大海捞针”，难以在超高野生型背景中精准识别出这些低频突变。现有主流技术各有限制：扩增阻滞突变系统定量PCR（ARMS-qPCR）灵敏度不足，数字PCR（ddPCR）靶标检测通量有限，新一代测序技术在追求超高灵敏度和高检测通量的同时，面临成本高、周期长的难题。因此，发展兼具高灵敏度、高多重性及临床实用性的低频突变检测技术，仍是当前分子诊断领域的迫切需求。
近日，厦门大学杨朝勇/福建医科大学许醒团队，报道了一种能够在超高野生型核酸背景下实现低频突变高灵敏检测的新方法（Hybrid Ultrasensitive Nucleic acid Targeted Enrichment and Readout, HUNTER)。HUNTER通过将焦磷酸解激活聚合（PAP）反应的高选择性富集能力与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）的高精度检测优势融合，构建了兼具高性能与临床实用性的液体活检新范式，为推进癌症精准诊疗的临床应用提供了强有力的技术支撑。该技术利用DNA聚合酶的焦磷酸解活性（[dNMP]n + x[PPi] ⇌ [dNMP]n-x + x[dNTP]），通过在PAP引物3'端引入双脱氧核苷酸（ddNMP）作为阻断基团，确保引物仅在与突变模板完全互补时，通过焦磷酸解反应切除阻断基团并启动延伸扩增，从而实现对低频突变的高选择性富集。随后，通过MALDI-TOF-MS直接检测单碱基延伸产物的质荷比（m/z），实现单核苷酸分辨率的精准鉴定。该平台首创“选择性富集—质谱直接检测”一体化新策略，有效突破了低频突变在高背景野生型干扰下检测灵敏度不足的技术瓶颈，实现了检测灵敏度（0.01% 变异等位基因频率）、准确性（100%特异性）与多重检测能力（10个靶标）的协同突破。
图1. HUNTER示意图
在临床验证中，HUNTER平台展现出显著优于当前临床主流技术ARMS-qPCR的综合性能。在70余例肺癌患者cfDNA检测中，HUNTER对EGFR突变的检测灵敏度达到87.5%-100%，较ARMS-qPCR提升1.6-5倍，同时保持100%的特异性。尤为重要的是，HUNTER能够精准识别传统ARMS-qPCR难以检测的复杂共存突变模式，为临床提供更全面的基因分型信息。除此之外，HUNTER的单样本检测成本可控制在2美元以下，大幅降低了精准检测的经济门槛，使得高通量、低成本的液体活检大规模临床应用成为可能。这一技术突破为肿瘤分子分型、靶向用药指导和耐药监测提供了更可靠、更经济的解决方案，在推动肿瘤精准诊断与个体化治疗普及方面具有重要价值。
图2. HUNTER的临床应用
这一成果近期发表在Journal of the American Chemical Society 上，由厦门大学博士研究生梁珊珊、硕士研究生宁宇与厦门大学附属第一医院吴晓婷主治医师共同完成。本工作获得国家自然科学基金委项目、中元汇吉生物股份有限公司企业合作项目等支持。
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Sensitive and Accurate Detection of Low-frequency Mutations via Pyrophosphorolysis-Activated Selective Amplification and MALDI-TOF-MS Single-Nucleotide Resolution ldentification
Shanshan Liang, Yu Ning, Xiaoting Wu, Guihua Zhang, Yinuo Hou, Rui Wang, Xing Xu*, Chaoyong Yang*
J. Am. Chem. Soc. 2025, DOI: 10.1021/jacs.5c08741
【通讯介绍】
杨朝勇，厦门大学化学化工学院特聘教授，上海交通大学医学院分子研究员，上海交通大学医学院分子医学研究院副院长，国家杰出青年科学基金获得者。中国分析测试协会核酸分析主任，中国化学会化学生物学专业委员会副主任，谱学分析与仪器教育部重点实验室副主任，中国生物传感，生物芯片与纳米生物技术专业委员会委员，《Analytical Chemistry》期刊副主编，在《Nat. Biotechnol.》、《Nat. Commun.》、《Sci. Adv.》、《PNAS》、《JACS》以及《Angew. Chem. Int. Ed.》等学术刊物上发表论文300余篇，论文被引超过15000次，H index=75，获授权发明专利70余项。曾获得中国化学会-英国皇家化学会青年化学奖、美国化学会测量科学进展讲座奖、中美化学与化学生物学教授协会杰出教授奖、中国青年分析化学家奖、科技部中青年科技创新领军人才、中组部等9部委《全民科学素质行动计划纲要》实施工作先进个人、福建省科技进步一等奖、福建省高校领军人才、福建省科技创新领军人才、福建省五四青年奖章、厦门市双百计划领军型创业人才等多个奖项与称号。
https://www.x-mol.com/university/faculty/14060
许醒，福建医科大学医学技术与工程学院医学检验系副教授，硕士生导师。任中国分析测试协会核酸分析分会秘书长。从事单细胞时空测序、液体活检新方法开发等研究。主持国家自然科学基金及福建省自然科学基金等各类项目。先后在《Nat. Commun.》、《J. Am. Chem. Soc.》、《Small Methods》、《Anal. Chem.》、《Chem. Sci.》等发表SCI论文20余篇，授权和申报国家发明专利9项，其中2项已转让。获福建省高层次人才、厦门市科技进步一等奖等荣誉。
