萜类化合物的羟基化修饰能够显著提高其水溶性与分子靶点的结合能力，在生物活性物质合成中具有重要意义。羟基化萜类的天然生物合成通常需要两类酶顺序协作（图1A）：（1）萜烯合酶（TSs）通过碳正离子级联反应构建萜类碳骨架；（2）细胞色素 P450 单加氧酶（CYP450）以烷基自由基氧化方式引入羟基。然而，CYP450单加氧酶存在催化混杂、区域/立体选择性有限、异源可溶性表达困难以及对 NAD(P)H 的依赖等问题，导致其应用受限。
图1. (A) 萜烯合酶偶联CYP450合成双羟基化萜烯; (B) 萜烯合酶催化的水分子介导的碳正离子猝灭合成双羟基化萜烯。
尽管部分萜烯合酶可通过水介导的碳正离子淬灭直接生成单羟基萜烯（无需CYP450参与），但多羟基萜烯的合成仍依赖复杂的多酶耦合系统。迄今为止，仅有两例双羟基化萜烯合酶报道：来源于玉米 (Zea mays) 的eudesmane-2,11-diol合酶和来源于雷公藤 (Tripterygium wilfordii) 的cryptomeridiol合酶。然而，它们的结构基础与催化机制尚未阐明，严重限制了双羟基化萜烯合酶在高选择性、多位点羟基化生成多羟基萜类化合物中的开发与应用（图1B）。
近日，华东理工大学许建和团队与中山大学巫瑞波团队在 J. Am. Chem. Soc. 报道了第三例双羟基化萜烯合酶（同时也是首例微生物来源的双羟基化酶）——来自 Penicillium expansum 的 eudesmane-2,11-diol 合酶 PeTS3（图1B），并首次解析了双羟基化萜烯合酶的晶体结构。结合结构分析、定点突变以及量子力学/分子力学（QM/MM）多尺度计算，对该酶催化反应的构象变化和反应控制机制进行了阐述。
结构比对显示（图2），PeTS3结合底物后会发生从开放态到闭合态的构象转变，其中Loop 246-253的柔性变化对活性口袋闭合至关重要。定点突变实验证实，Arg252是维持该Loop稳定的关键残基，其突变会导致中性中间体1 (hedycaryol)的提前释放，仅生成单羟基产物。
图2. (A) PeTS3-BTAC-PPi-Mg2+复合物结构与apo-PeTS3结构的对比分析; (B) Mg2+离子(绿球)、焦磷酸基团与活性位点残基的相互作用; (C) PeTS3-BTAC-PPi-Mg2+复合物与apo-PeTS3的Loop 246-253和Residues 324-330的结构差异; (D) Loop 246-253在酶开放及关闭构象下的结构变化; (E) Gln248和Arg252的突变产物GC-MS分析结果。化合物1* (elemol) 为中心中间体1 [(+)-hedycaryol] 的Cope重排产物，化合物5为eudesmane-2,11-diol; (F) R-Y二联体与焦磷酸集团和Asp107的相互作用。
由PeTS3催化的形成双羟基化萜烯的反应中最为关键的化学过程（图3）是：（1）水分子亲核进攻碳正离子中间体IM-A，形成单羟化的中性中间体1；（2）中性中间体1的再质子化，形成新的碳正离子；（3）第二次水分子亲核进攻碳正离子中间体IM-C形成双羟基化萜烯。
图3. PeTS3催化FPP环合形成二羟基萜烯的环合机制。碳原子编号与底物法尼基焦磷酸(FPP)一致。
结合量子力学/分子力学（QM/MM）计算、分子动力学模拟及定点突变实验，作者揭示了PeTS3通过分步碳正离子淬灭机制合成二羟基萜烯的精准调控过程（图3）：
首次羟基化：Tyr172-Wat519-Cys197(主链羰基)组成的氢键网络调控水分子对碳正离子中间体 IM-A的亲核进攻，生成氧鎓盐形式的单羟基中性中间体1 [(+)-hedycaryol]——IM-A2；
碳正离子重新激活：在柔性区域的Cys197主链羰基首先扮演广义碱拔掉IM-A2上的质子，然后通过扭转，传递质子到WAT535上，形成WAT-535的氧鎓盐（水合氢离子），经Tyr312-Ser202-His84-Wat571构成的氢键网络而稳定。中性中间体随后接收WAT-535氧鎓盐上的质子进行重新再质子化，激活碳正离子，引发进一步环化。
二次羟基化：中性的WAT-535扮演亲核试剂，淬灭碳正离子，完成第二次羟基化。该过程中，Cys197的主链羰基和Tyr312作为氢键受体，与水分子上的极性氢形成氢键作用，增强了WAT-535的亲核能力。Y312-S202-H84三联体参与维持这种精巧的氢键网络系统。
对氢键网络相关残基的定点突变，证实了这些极性残基通过维持氢键网络稳定性，调控水介导的碳正离子淬灭和中间体再质子化过程，对双羟基化反应至关重要。
图4. (A) QM/MM计算捕获的化合反应关键中间体; (B) Tyr172、Cys197、Gly198的位点突变分析; (C) Tyr312的位点突变分析; (D) His84的位点突变分析; (E) Ser202的位点突变分析。括号中给出了相对于IM-A模型的能量值（kcal/mol），白色箭头上方指示了能量势垒。每个步骤中涉及的关键残基使用小麦色显示，而其他残基则以白色显示。碳正离子呈现为绿色；无环倍半萜6为橙花叔醇；由野生型PeTS3（WT）形成的化合物1和5的产量被指定为100%，用于定义相对产量。星号（*）表示二羟基萜烯5在PeTS3或其变体产生的总萜烯中的比例。
总之，该工作首次解析二羟基萜烯合酶的晶体结构，阐明其时空精准调控的水介导二羟基化机制，揭示了极性残基和动态氢键网络在萜烯合酶催化羟基化修饰中的核心作用，丰富了萜烯合酶的催化机制理论，填补了二羟基萜烯生物合成的结构生物学空白，为通过蛋白质工程改造萜烯合酶、开发新型多羟基萜烯合酶提供了设计策略。不依赖CYP450单加氧酶的多羟基萜烯生物合成系统的建立，简化了传统多酶耦合体系，降低了代谢平衡调控难度，为构建高效合成多羟基萜烯的细胞工厂奠定了基础，在药物合成、生物农药等领域具有广阔应用前景。
本文的通讯作者为华东理工大学许建和教授、中山大学巫瑞波教授。华东理工大学黄政瑜、中山大学徐康为、华东理工大学李文丽为本文共同第一作者。
原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：
Dihydroxy Terpene Synthase: Spatiotemporally Precise Manipulation of Water-Mediated Dihydroxylation via Stepwise Quenching of Carbocations
Zheng-Yu Huang, Kangwei Xu, Wen-Li Li, Chun-Xiu Li, Jiang Pan, Ruibo Wu*, Jian-He Xu*
J. Am. Chem. Soc. 2025, DOI: 10.1021/jacs.5c19381
研究团队简介
许建和教授，本科毕业于清华大学化学系，华东理工大学与京都大学联合培养博士。现任华东理工大学特聘教授、省部共建上海生物制造协同创新中心常务副主任；曾任生物反应器工程国家重点实验室主任( 2006-2017)和生物工程学院副院长(2006-2015)。创立并主编英文期刊Bioresources and Bioprocessing (简称BIOB)，被SCI收录，位列JCR Q1区，影响因子IF2023 = 4.3。主要从事酶工程、合成生物学及生化工程研究，主持完成国家重点研发计划项目(2020-2024)、973计划课题、863计划课题(2项)和11项国家自然科学基金项目(含1项重点基金)。迄今在JACS, Angew Chem, ACS Catal, ACS Sustainable Chem Eng等期刊发表论文500余篇，被引用11000多次。主编出版《生物催化工程》、《生物催化剂工程》、简明百科全书《Catalysis, From A to Z》(Wiley, 第5版)等著作。公开发明专利90多项，授权100项，多项技术转让企业。荣获国家级人才、全国优秀教师、国务院政府特殊津贴、上海市领军人才、谈家桢生命科学创新奖、杜邦杰能科中国酶工程杰出贡献奖、上海市技术发明一等奖(第一完成人)。
许建和
https://www.x-mol.com/university/faculty/78665
巫瑞波
https://www.x-mol.com/university/faculty/18498
