中国科学院上海有机化学研究所陈以昀研究员（生命过程小分子调控全国重点实验室）与张耀阳研究员（生物与化学交叉中心）、复旦大学王任小教授团队合作，在生物正交标记技术领域取得重要进展。研究团队发展出可见光驱动的酮基自由基偶联新策略，首次在活细胞实现了蛋白质的原子级精度标记与交联。该方法通过可见光催化高效生成稳定的二芳基酮自由基，有效规避了传统紫外激发技术因高能光照导致的选择性差、副反应多及背景干扰强等固有缺陷，显著提升了标记特异性与生物相容性。此项研究为解析活细胞内蛋白质动态互作与功能提供了高精度、低扰动的新一代化学工具，相关成果发表于《美国化学会志》（J. Am. Chem. Soc.）。
图1. 可见光催化机制突破：从非特异性副反应（左）到精准自由基偶联（右）
创新机制：突破传统自由基反应生物应用局限
针对传统自由基反应在生物应用中存在的选择性与靶向性难题，研究团队系统解析了传统紫外激发交联技术的核心瓶颈：其产生的三线态双自由基（高活性且难以调控的反应中间体）易引发环加成和氢原子攫取等副反应，导致非特异性交联和生物分子损伤。基于陈以昀课题组在光催化温和生成酮基自由基（Angew. Chem., Int. Ed. 2016）、蛋白质标记（JACS Au 2021）、脂质标记（Nat. Chem. 2025）及核酸标记（Chin. J. Chem. 2025）等领域的系统性研究积累，团队经过多年攻关，成功构建了新型可见光催化体系。该体系在水溶性钌催化剂与抗坏血酸的协同作用下，通过单电子转移机制在中性水相中高效生成稳定的二芳基酮自由基，首次实现了生物正交条件下的精准频哪醇偶联。该机制避免了三重态双自由基的形成，通过空间位阻和共振效应延长自由基寿命，同时降低传统 HAT/[2+2] 副反应。这些酮基自由基的超快均相偶联（速率常数 k=5.9×107 M-1 s-1）能够竞争过生物分子淬灭途径，实现生物正交的蛋白质修饰与交联，将副反应发生率从传统方法的>20%显著降至5%以下，从根本上提升了交联特异性与生物相容性。
图2. 稳定自由基介导的交叉偶联新机制：温和条件下实现高正交性偶联
技术颠覆性：操作简化的高效互作蛋白交联新策略
作为解析蛋白质-蛋白质相互作用的关键技术，本方法实现了极简化操作下的高效精准交联：仅需在目标蛋白特定位置引入光交联探针苯甲酮丙氨酸（Bpa），即可通过光催化触发高效交联，显著优于传统多步骤、低特异性的交联策略。实验结果表明，在PyrI4的A138、Q62、PAPS的Y191、Bcl-XL的V126及Bid的I83等位点引入Bpa后，均能在光催化条件下实现位点特异性交联。串联质谱验证了Bpa残基间频哪醇连接的形成，支持了酮基自由基偶联的交联机制。对照实验证实交联反应依赖于蛋白质间的邻近作用：在Bcl-XL的远端位点A171引入Bpa，或通过热处理破坏蛋白质相互作用，均会抑制交联；非相互作用蛋白的交叉实验进一步证实了邻近作用的关键作用，验证了该方法的特异性。为评估Bpa引入对蛋白质结构和功能的影响，研究人员进行了分子动力学模拟和生物物理实验，表明光催化酮基自由基偶联策略在实现精准蛋白质修饰的同时，能保留天然蛋白质的结构和功能。这一突破不仅提供了“分子尺”级的精准测量工具，更为动态生命过程研究奠定了新一代方法学基础。
图3. 蛋白质交联质谱证据：频哪醇键实现原子精度交联
广泛适用性：多尺度正交标记反应的交叉兼容
为验证该反应在蛋白质标记中的适用性，研究人员通过SulfoNHS-BP 5将二苯甲酮基团修饰到Bcl-XL蛋白上，并设计合成了含生物素报告基团和二苯甲酮结构的标记探针Biotin-BP 6。在Ru (bpy)3Cl2、VcH 存在下经蓝光照射后，Western blot分析显示Bcl-XL蛋白被高效标记，而未修饰的Bcl-XL无标记信号，证实了反应特异性。研究团队发现该光正交反应展现出卓越的兼容性，可与张力促进的炔-叠氮环加成（SPAAC）和逆电子需求的Diels−Alder（IEDDA）等经典生物正交技术交叉兼容，实现多重蛋白质标记。研究人员将光催化酮基自由基偶联与SPAAC、IEDDA反应组合，在一锅体系中同时处理分别标记有不同正交基团的三种蛋白质（GST-TCO、Oval-DBCO和Bcl-XL-136Bpa）及其对应生物素化探针。严格的控制实验证实各反应通道间交叉干扰低于5%，均能独立高效地实现特异性标记，为复杂蛋白质体系的多维度研究提供了新型工具。
图4. 酮基自由基偶联反应与环加成反应的正交解析
应用价值：推动生物医学研究的精准化进程
在活细胞标记实验中，研究人员利用细胞不透性的 SulfoNHS-BP 5修饰HeLa细胞表面膜蛋白的赖氨酸残基，随后加入反应混合物并经蓝光照射，流式细胞术进一步证实了标记的特异性。MTT细胞活力测定显示，HeLa和HEK293T细胞经光催化标记后无明显细胞毒性，证实了该方法优异的生物相容性。在原代神经元模型中的验证显示，标记后神经元存活率高达84%±2%，进一步证明了该方法在复杂脆弱生命系统中的适用性与生物正交性。共聚焦显微镜图像显示特异性标记信号显著增强，与神经元完整性标志物MAP-2高度共定位，信噪比提高5倍以上。为实现更高精度的位点特异性蛋白质修饰，研究者利用遗传密码扩展技术，将二苯甲酮类非天然氨基酸Bpa定点插入到目标蛋白（如Bcl-XL、荧光蛋白mCherry、纳米抗体7D12）的特定位置。在活细胞膜蛋白修饰应用中，研究人员将Bpa定点引入高亲和力EGFR结合纳米抗体7D12的K76残基（远离 EGFR 结合结构域）。向表达EGFR-EGFP的HEK293T细胞加入修饰后的纳米抗体7D12-76Bpa，结合后经光催化与Biotin-BP 6偶联，共聚焦显微镜证实活细胞膜上的高效标记。野生型7D12对照实验显示极低的背景荧光，叠加图像与线性曲线分析证实标记信号与EGFR-EGFP表达区域高度共定位，成功验证了该策略在活细胞膜上的位点特异性修饰能力。
图5. 高存活率与高信噪比：原代神经元及癌细胞靶向标记技术的新突破
该技术的突破性价值体现在三个核心维度：1）特异性显著提升，将内源性活性氨基酸的非特异性反应降低3–20倍；2）具备优异的生物相容性，在原代神经元模型中实现84%的细胞存活率，信噪比提升超过5倍；3）复杂生物环境适用性，通过将Bpa精准整合至靶向EGFR的纳米抗体7D12，并实现EGFR过表达细胞模型时间分辨的特异性标记，为受体靶向药物筛选与精准医学研究提供了关键技术支撑，展现出广阔的转化应用前景。
本研究由上海有机所博士生谭嘉威、郝柯嘉、袁艺等人共同完成，通讯作者为陈以昀研究员、张耀阳研究员与王任小教授。研究工作获得了国家自然科学基金重点项目、中国科学院先导专项、上海市科学技术委员会及生命过程小分子调控全国重点实验室的资助。
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Bioorthogonal Photocatalytic Protein Labeling and Cross-Linking Enabled by Stabilized Ketyl Radicals
Jiawei Tan#, Kejia Hao#, Yi Yuan#, Shasha Xie#, Li Qi#, Qiaoling Che#, Yan Li, Renxiao Wang*, Yaoyang Zhang*, Yiyun Chen*
J. Am. Chem. Soc. 2025, DOI: 10.1021/jacs.5c18652
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