能够特异性与靶标蛋白形成共价键的分子被广泛用于开发基于活性的探针（activity-based probe）和共价抑制剂（covalent inhibitor）。与基于可逆“结合-解离”平衡的常规配体分子不同，上述共价功能分子通过其亲电基团与靶标蛋白的亲核基团反应形成稳定共价键，从而避免解离效应的负面影响。因此，共价抑制剂在低靶标浓度或复杂生物环境中仍能保持高效抑制作用，在降低剂量和简化药动方面具备优势。尽管如此，共价抑制剂的开发仍旧面临一个关键挑战，即如何在维持高靶标反应活性的同时避免脱靶反应 [1]。合理选择共价弹头（covalent warhead，即负责与靶蛋白发生特异性交联的亲电基团），并将其精确定位于靶蛋白的特定残基附近，是平衡反应活性与选择性的核心策略之一。芳基氟代硫酸酯（arylfluorosulfate, AFS）是一类重要的硫氟交换（sulfur fluoride exchange, SuFEx）化学官能团，近年来展现出作为共价弹头的独特潜力（图1a）[2]。AFS能够与赖氨酸、酪氨酸、组氨酸、丝氨酸等多种氨基酸残基侧链形成共价键，并且在生理条件下表现出比磺酰氟（sulfonyl fluoride, SF）类共价弹头更高的化学稳定性与更低的脱靶反应性，是开发高选择性共价功能分子的理想共价弹头。然而，AFS固有的温和亲电性导致其与靶标蛋白的反应动力学较慢，反应半衰期通常为小时量级，限制了其用于开发高靶标反应活性共价功能分子的广泛潜力。
近日，来自清华大学和南京大学的研究者们在Journal of the American Chemical Society 上发表了题为“Fast and Site-Specific Covalent Targeting of Proteins by Arylfluorosulfate-Modified Aptamers”的论文 [3]。该研究基于兼容AFS化学修饰的体外筛选技术，以人表皮生长因子受体3胞外结构域（extracellular domain of epidermal growth factor receptor 3, HER3-ECD）和人血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）为靶标蛋白，发现了一系列AFS修饰的共价适体（AFS-Ap，图1b）。这些AFS-Ap在保持高选择性的同时实现了对靶标蛋白的位点特异性快速交联，其反应半衰期（t1/2）快至约1分钟，交联反应速率常数（kinact）高达0.013 s-1，较常见的其他AFS类共价功能分子提高了1~2个数量级，挑战了AFS类共价弹头温和亲电性必然伴随温和反应性的传统认知。
图1.（a）典型SuFEx亲电基团的化学结构。（b）AFS-Ap对其靶标蛋白的共价靶向机制。AFS-Ap首先与蛋白质结合形成可解离复合物，随后AFS-Ap的弹头W与蛋白质残基X之间发生近接交联反应，生成不可解离的交联物。（c）体外筛选AFS-Ap原理示意图，每轮筛选包括4个步骤：①基于dATP-α-S的PCR，合成含有PS修饰的DNA文库（PS-DNA文库）；②对PS-DNA文库进行共价弹头功能化，得到含有AFS修饰的DNA文库（AFS-DNA文库）；③AFS-DNA文库与靶标蛋白反应，并分离“DNA-蛋白”交联物；④移除交联物中DNA的化学修饰并恢复天然DNA结构，以便高效PCR扩增优势序列。
基于研究团队前期工作中建立的共价适体体外筛选平台（SuFEx in vitro selection）[4]，该研究工作成功实现在AFS修饰的随机寡核苷酸序列文库中发现共价适体（图1c）。由于AFS固有的温和亲电性，原有筛选方法在初始筛选轮次中无法产生可检测量的共价交联产物，阻碍了优势序列的富集。为此，研究者首先以HER3-ECD为靶标蛋白、SF为共价弹头进行筛选，获得一例具有高效交联能力的SF修饰共价适体（SF-Ap），再将SF-Ap与HER3-ECD反应后形成的共价交联物作为电泳定位参照，在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中明确指示目标共价交联物条带的位置（图2a），进而，用AFS修饰的随机寡核苷酸序列文库进行筛选时，实现了极微量优势序列的高效分离富集，打通了图1c所示的AFS-Ap共价适体体外筛选循环。
图2.（a）以SF-Ap作为“定位参照”指示目标共价交联物条带位置的凝胶电泳示意图。（b）fAFS-Seq1-HER3位点特异性交联HER3的赖氨酸314（K314）。（c）fAFS-Seq1-HER3、bAFS-Seq11-HER3与靶标蛋白HER3-ECD以极快速率交联。（d）fAFS-Ap阻断HER3/EGFRs异源二聚过程的原理示意图。（e）免疫印迹实验显示fAFS-Seq1-HER3通过共价交联HER3-ECD抑制heregulin诱导的HER3/EGFRs异二聚化及下游信号通路，并引起T-HER3条带上移；而SF修饰的适体分子SF-Seq1-HER3则不具有该调控活性。
氟取代与无取代的芳基氟代硫酸酯（分别为fAFS与bAFS）是AFS类共价弹头的两种典型衍生物（图1a）。研究团队分别采用fAFS与bAFS作为共价弹头，以HER3-ECD为靶标进行了8轮体外筛选，成功发现分别携带这两种共价弹头的高活性共价适体fAFS-Seq1-HER3与bAFS-Seq11-HER3。蛋白质串联质谱（LC-MS/MS）分析显示fAFS-Seq1-HER3特异性交联HER3蛋白的K314赖氨酸残基（图2b）。fAFS-Seq1-HER3与bAFS-Seq11-HER3均展现出极快的靶标交联动力学（图2c），t1/2约为1分钟，kinact分别达到0.013 s-1（fAFS-Seq1-HER3）与0.011 s-1（bAFS-Seq11-HER3）。fAFS-Seq1-HER3具有优异的靶向选择性，与多种常见干扰蛋白未见明显脱靶交联，能在50%人血清环境中有效识别并交联HER3-ECD蛋白，并共价抑制HER3与其他表皮生长因子受体（extracellular domain of epidermal growth factor receptors, EGFRs）的蛋白互作（图2d、2e）。此外，fAFS-Seq1-HER3在生理温度与pH条件下显示出高稳定性，其水解半衰期超过144小时，远高于此前报道的SF修饰适体（水解半衰期6小时）。
图3.（a）PS立体构型对AFS-Ap交联反应活性的影响。在相同反应条件下，仅具有单一RP构型PS的AFS-Ap能够与HER3-ECD发生高效交联，具有外消旋RP/SP构型PS的对应序列反应活性则显著降低。（b）fAFS-Seq1-HER3核心序列的模拟二级结构示意图。其中，红色实线框标示的核苷酸为功能必需，蓝色虚线框标示的核苷酸在突变分析中显示出一定的序列容忍性。（c）弹头结构对Seq1-HER3交联活性的影响。将fAFS-Seq1-HER3中的弹头分别替换为SF或bAFS后，其与HER3-ECD的交联活性几乎丧失。
fAFS-Seq1-HER3所表现出的高靶标反应活性并非依赖于共价弹头的亲电性，而是由共价弹头化学结构与适体保守序列共同构筑的“适体-蛋白”精准结合界面所主导。首先，作为共价弹头引入位点的硫代磷酸酯（phosphorothioate, PS）的立体构型对反应效率具有决定性影响。相较于化学合成所得的外消旋PS（RP/SP混合），单一RP构型PS的fAFS-Seq1-HER3才具备高靶标反应活性，表明PS立体构型专一性对构筑精准结合界面的重要作用（图3a）。其次，将fAFS替换为亲电性更强的SF或结构不同的bAFS，均导致共价适体丧失原有的高靶标反应活性，证明精准结合界面上的共价弹头化学结构是关键因素，而非其亲电性（图3b、3c）。此外，对fAFS-Seq1-HER3适体核心序列的扰动显著影响其活性，展现其高度保守的适体核心序列的必要性。
图4.（a）fAFS-Seq4-VEGF核心序列的模拟二级结构示意图。其中，红色实线框标示的核苷酸为功能必需，蓝色虚线框标示的核苷酸在突变分析中显示出一定的序列容忍性。（b）fAFS-Seq4-VEGF与靶标蛋白VEGF165以极快速率交联。（c）fAFS-Seq4-VEGF阻断VEGF/VEGFR2间PPI过程的原理示意图。（d）免疫印迹实验显示fAFS-Seq4-VEGF通过共价交联VEGF165抑制VEGF/VEGFR2间PPI过程及下游信号通路。
针对不同靶标蛋白筛选发现兼具高反应性和选择性的AFS-Ap具备一定的普适性。研究团队还开展了靶向VEGF165的AFS-Ap筛选工作（图4）。所发现的fAFS-Seq4-VEGF在保持高选择性的同时，能够高效交联VEGF165，t1/2约2分钟，kinact达0.0055 s-1，并实现对VEGF与其受体（VEGFR2）的蛋白互作的共价抑制。
作者在论文总结讨论章节提到，“适体-蛋白”精准结合界面的形成可能源于在随机序列文库中进行体外筛选时产生的分子进化机制。在多次筛选循环中，某些具有催化功能的折叠构象得以富集，这些序列能够显著加速温和AFS共价弹头与靶标蛋白特定位点之间的交联反应，这可能是论文中AFS-Ap展现出远超其他常见AFS分子的高反应活性的原因。此外，论文中的筛选方法目前存在两点局限：一是所得AFS-Ap分子不一定具备共价抑制蛋白互作的活性，还需结合细胞水平筛选或活性导向筛选策略加以优化；二是依赖A碱基编码共价弹头，限制了文库多样性，但有望引入非天然碱基对来解决。
清华大学化学系2021级博士生张恺宁和2023级博士生李娟为论文的共同第一作者，通讯作者为清华大学化学系向宇副教授，其他合作者包括南京大学张晶晶教授课题组、清华大学化学系童爱军教授课题组、清华大学分析中心石文昊研究员和朱奕颖研究员，经费支持来自于国家重点研发计划和国家自然科学基金。
参考文献：
[1] Cohen, M. S. et al. Structural bioinformatics-based design of selective, irreversible kinase inhibitors. Science 308, 1318-1321 (2005)
[2] Barrow, A. S. et al. The growing applications of SuFEx click chemistry. Chem. Soc. Rev. 48, 4731-4758 (2019).
[3] Zhang K. N. et al. Fast and Site-Specific Covalent Targeting of Proteins by Arylfluorosulfate-Modified Aptamers. J. Am. Chem. Soc. DOI: 10.1021/jacs.5c14374 (2025)
[4] Qin Z. C. et al. Discovering covalent Inhibitors of protein-protein interactions from trillions of sulfur(VI) fluoride exchange-modified oligonucleotides. Nat. Chem. 15, 1705-1714 (2023)
