东莨菪碱（scopolamine，7）是一种来源于茄科植物的代表性托品烷生物碱，临床上主要作为镇静剂和抗痉挛药使用，广泛应用于麻醉镇痛以及晕动症的治疗。由于东莨菪碱生物合成过程涉及由非血红素铁和2-酮戊二酸依赖性酶（Fe/2OG）——莨菪碱6β-羟化酶（H6H）催化的两个连续氧化反应，其生物合成一直备受关注（图1）。近日，美国德克萨斯大学奥斯汀分校（UT Austin）刘鸿文（Hung-wen Liu）教授团队利用一系列莨菪碱类似物作为探针研究H6H的催化反应，揭示了长期以来被广泛引用的“底物-辅因子空间取向模型”在解释H6H催化行为时的局限性，并进一步提出了一个更精细的模型，强调了底物C6位取代基与酶活性中心铁氧中间体之间的氢键相互作用在决定反应选择性（羟基化/环氧化）中的关键作用。
图1. H6H催化连续氧化反应生成东莨菪碱的机制
H6H是研究非血红素铁酶的一个理想模型，因其具有双重催化功能，既能催化莨菪碱（hyoscyamine，1）的C6-羟基化（1 → 3），又能催化生成的6β-羟基莨菪碱（3）发生进一步环氧化产生东莨菪碱（3 → 7）。以上两步反应均涉及氢原子的攫取（分别从C6或者C7），却导向不同的反应结果。为了解释这一现象，学界此前基于晶体学、光谱学研究以及与相关卤化酶催化行为的比较，提出了“底物-辅因子空间取向模型”。该模型认为，底物中待断裂的C‒H键相对于铁氧中间体的空间取向决定了氢原子攫取的效率，并由此可以预测后续是发生羟基化（“羟基反弹”）还是环氧化反应。
为检验“底物-辅因子空间取向模型”的准确性，刘鸿文教授研究团队设计并合成了一系列在C6和C7位带有环丙基、亚甲基、氟、甲氧基和三氟甲氧基等取代基的莨菪碱结构类似物，并系统考察了它们与H6H的催化反应。研究者获得了若干突破性结果，对既有理论模型提出了重要挑战。
首先，他们发现C6自由基寿命远超预期。使用C7-螺环丙烷“自由基钟”类似物（10）进行实验（图2），并未检测到预测的C6羟基化产物（12），而是观察到环丙烷开环形成的烯烃产物（11）。这表明C6自由基中间体的实际寿命（>10 ns）比理论计算值（0.16 ns）长得多，暗示H6H的底物-铁复合物在催化过程中可能具有动态性，而非晶体结构显示的静态构象。然后研究者揭示反应区域选择性不只取决于C‒H键的空间取向，因为对于含有C7-亚甲基的类似物（13），反应同时产生了C8羟基化产物（14）和7,8-环氧化产物（15），但并未产生模型所预测的C6羟基化产物（16）。这表明，除了底物C‒H键的空间取向外，还有其他因素显著影响着羟基反弹的区域选择性。
接下来的实验表明，C6位取代基对反应走向具有关键影响：当以6-甲氧基类似物为底物，发生了甲氧基的氧化脱甲基（17 → 19），而非C7羟基化。更值得注意的是，6-三氟甲氧基类似物没有发生预测的C7羟基化，却出人意料地发生了N-脱甲基反应（18 → 20）。这是首次报道H6H能催化N-脱甲基化。这些结果提示，当C6位存在大体积不易被氧化的取代基时，可能阻碍了原本更易发生的C6-H氧化反应，并将反应“重定向”至空间距离相似的N-甲基。另外，为深入探究第一步天然氧化产物的C6羟基对决定反应走向的作用，研究者使用6β-氟代莨菪碱进行实验。结果显示，该底物其先经C6羟基化并脱氟生成酮衍生物（21 → 22 → 23），随后被H6H催化发生C7羟基化，最终生成产物24。同位素标记实验（18O2/H2O和O2/H218O）证实，23的第二步C7羟基化是通过羟基反弹机制实现的，而非经由环氧化开环途径。这提示，在莨菪碱的天然氧化产物6β-羟基莨菪碱（3）中，其C6羟基与铁氧/羟基铁中间体之间形成的氢键（参见图1中反应中间体4、5和6的结构），不仅可能作为引导H原子从C7（而非N-甲基）攫取的“锚点”，还能稳定生成的羟基铁复合物，抑制其向C7自由基的反弹，从而为环氧化反应的发生创造条件。
图2. H6H催化莨菪碱类似物的反应结果
基于系统的实验证据，研究者提出了一个优化的H6H催化模型。该模型认为，底物的构象动态性、氢原子转移所需的底物空间取向，以及底物与铁氧复合物中间体之间的氢键相互作用，三者之间存在复杂的协同效应，共同调控H6H反应的选择性和反应结果。综上所述，该研究突破了以往主要依赖“底物-辅因子空间取向”来解释Fe/2OG酶催化选择性的传统视角，揭示了H6H催化过程中多种结构因素与动态相互作用协同调控反应路径的复杂机制。这一认识不仅深化了对Fe/2OG酶家族功能多样性的理解，也为今后基于结构的酶理性设计、定向进化及其在生物合成与生物催化中的应用奠定了更为坚实的理论基础。
该项工作近期发表在Journal of the American Chemical Society 上，牛丸理一郎教授（日本九州大学）和陈日道研究员（中国医学科学院药物研究所）为本论文的共同第一作者，美国德克萨斯大学奥斯汀分校刘鸿文教授为通讯作者。
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Refining the Substrate-Cofactor Disposition Model of Hyoscyamine 6β-Hydroxylase Catalysis Using Hyoscyamine Analogs
Richiro Ushimaru, Ridao Chen, Po-Hsun Fan, Xiao Liu, Mark W Ruszczycky, Hung-Wen Liu
J. Am. Chem. Soc., 2025, 147, 46543–46549, DOI: 10.1021/jacs.5c17484
研究团队介绍
刘鸿文（Hung-wen Liu）教授，美国德克萨斯大学奥斯汀分校（University of Texas at Austin）自然科学学院化学系以及药学院化学生物学和药物化学系教授。刘教授团队的研究兴趣在于化学和生物学交叉学科的重要科学问题，近年来主要致力于阐明重要天然产物生物合成酶的催化机制。其团队在国际著名学术杂志发表了多项具有重要影响力的研究成果。
刘鸿文
https://www.x-mol.com/university/faculty/361
实验室网站
https://sites.utexas.edu/liu/
