实时荧光定量PCR (qPCR)实验操作流程
实验原理：
实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）指的是在PCR进行的同时，对其过程进行监测的能力（即实时）。因此，数据可在PCR扩增过程中，而非PCR结束之后，进行收集。这为基于PCR的DNA和RNA定量方法带来了革命性的变革。在实时荧光定量PCR (qPCR)中，反应以循环中首次检测到目标扩增的时间点为特征，而非在一定循环数后目标分子累计的扩增量。目标核酸的起始拷贝数越高，则会越快观察到荧光的显著增加。相反，终点法检测（也称“读板检测”）测量的是PCR循环结束时累计的PCR产物量。
实验准备：
cDNA模板、引物、qPCR mix、ddH2O等。
实验步骤：
1.配样
按照实验需要对cDNA模板加水作适当稀释，涡旋混匀后离心，根据实际所检测样品和基因的数量计算加样体系，按照体系以此加入ddH2O，qPCR mix，引物，配成一管mix，涡旋混匀，后离心。准备适量的qPCR八连排板或者96孔板，在这里我们用的是八连排管，置于冰上操作，将上步混匀的mix按每孔19μL加入到八连排孔中。
2.加模板
在每个孔各加入1μL的cDNA模板。加样完毕后，盖上八连排管盖，注意尽量从孔边上压紧管盖。涡旋混匀后离心，去除气泡。
3.上机反应
上机前先设置程序，具体如下：设置反应温度，设置孔板信息，样品放入仪器中，开始反应。
4.导出数据
反应结束后得到qPCR数据，根据溶解曲线，查看数据的有效性，导出数据为EXCEL文件并保存。
5.实验结束
实验完毕，打开qPCR仪，取出八连排管，盖上qPCR仪，关闭电脑，仪器。
注意事项：
1.由于分装过程中，吸头具有表面张力，会导致样品损耗，因此根据实际需要，多配一些。
2.实验中用移液枪时注意保持相同的力度。匀速吸打。
3.操作应于冰上进行，防止因操作时间过长，影响酶活性。
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