人工关节假体周围感染(PJI)是高达2%的关节翻修术的灾难性并发症。病原体的鉴定对于PJI的抗菌治疗至关重要。然而，即使改进了培养技术，诊断仍然具有挑战性，20%的PJI中未发现病原微生物。作为一种成熟而全面的分子生物学技术，宏基因组二代测序技术(mNGS)在PJI患者病原体的诊断中显示出了潜在的潜力。然而，在PJI的管理中，mNG的最佳标本类型还未被研究。在这项研究中，使用三种类型的标本来评估mNGS的诊断价值，目的是为这些患者更好地选择mNGS检测标本。
方法
1
前瞻性招募了2017年10月至2019年4月期间接受关节翻修术的63名患者。根据纳入与排除标准（图1），从59例患者关节翻修术中收集了177例标本，包括假体周围组织、滑液和假体超声裂解液。每个标本被分成两份，一份用于mNGS，另一份用于培养。本病的诊断标准根据肌肉与骨骼感染协会(MSIS)(表1)的标准判定PJI(40例)和无菌性松动(19例)。
图1. 患者及标本选择、分类和比较的流程图。
DAIR：清创和植入物保留；mNGS：宏基因组二代测序；MSIS：肌肉与骨骼感染协会；PJI：人工关节假体周围感染。
表1. 肌肉与骨骼感染协会关于人工关节假体周围感染的标准。
结果
2
髋关节置换术(THA)25例，全膝关节置换术(TKA)34例。在该研究中，19例(32.2%)接受了无菌翻修，7例(11.9%)接受了清创和植入物保留(DAIR)，5例(8.5%)接受了一期翻修，28例(47.5%)接受了两期翻修中的第一期(图1)。总体而言，根据MSIS标准，40名患者(67.8%)被归类为PJI，19名(32.2%)被认为是无菌性松动。
当比较mNGS和培养的诊断性能时，无论是所有类型的标本组合在一起时，还是每种单一类型样本，mNGS在敏感性方面均优于培养。mNGS对假体周围组织的敏感度和特异度分别为62.5%和100%，对滑液的敏感度和特异度分别为87.5%和94.7%，对假体超声裂解液的敏感度和特异度分别为92.5%和94.7%（图2）。总体而言，mNGS的敏感性为95.0%(38/40)，而培养的敏感性为85.0%(34/40)。
图2. mNGS和培养结果在总样本和不同样本中的分布。
mNGS和培养的比较结果是：a) 所有类型的标本，b) 假体周围组织，c) 滑液，d) 假体超声裂解液。NPV，阴性预测值；NEG，阴性；POS，阳性；PPV，阳性预测值。
当所有标本组合在一起时，两种方法检测到的病原体匹配和部分匹配的病例占双阳性病例的97.0%(32/33)，而不匹配的病例仅占1例。假体周围组织双阳性中匹配和部分匹配占100%(14/14)，滑液双阳性中占95.7%(22/23)，假体超声裂解液双阳性中占90.9%(30/33)。在双阳性病例中，假体超声裂解液组有30例匹配和部分匹配病例，占PJIS的75%(30/40)，是三种标本中匹配和部分匹配最多的（图3）。
图3. 宏基因组二代测序的一致性。
40份PJI标本中，mNGS检测到的病原菌种类的一致性特征显示了mNGS检测结果的可靠性，进一步反映了mNGS对不同类型标本中病原菌的检测能力。在病原体匹配的mNGS结果中，三类标本中有14例(35%)呈相同的阳性序列，2例(5%)呈相同的阴性序列（图4）。在任何患者三类标本中都没有发现完全不一致的测序结果。在其他部分匹配的病例中(62.5%，n=25)，至少有一份标本覆盖了在所有三种类型的标本中检测到的所有病原体。在最能反映诊断效果的部分匹配病例中，假体超声裂解液(76%(19/25))对所有病原体(单病原体和多病原体)的检出率最高，其次是滑液(56%(14/25))。
图4. 三中标本的一致性和测序特征。
更广泛的测序参数可以进一步揭示测序性能。如图5a至5c所示，散点图显示了所有40个PJI中特定案例的序列参数。从基因组覆盖率(可能与检测到的病原体的可信度相关)的角度来看，假体超声裂解液检出病原体的平均覆盖率(13.7%)是假体周围组织(2.5%)和滑液(0.8%)的5倍。对于作为被检测病原体半定量指标的测序reads而言，假体超声裂解液的平均病原体测序reads(5905.90 reads)比假体周围组织(545.10 reads；p=0.000<0.01)和滑液(195.5 reads，p=0.000<0.01)的平均reads高出10倍(图5D)。
图5. 不同标本的测序特点。
a)测序覆盖率比较散点图；b)测序reads比较散点图；c)测序物种丰度比较散点图；d)三种类型标本的平均测序参数比较。mNGS，宏基因组二代测序；MSIS，肌肉与骨骼感染协会；SD，标准差。
mNGS和培养法检测的病原学特征如表3所示。与培养法相比，MNGS法对凝固酶阴性葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的检测无明显优势(p=1.00>0.05)，凝固酶阴性葡萄球菌和金黄色葡萄球菌是PJI中最常见的两种病原菌。值得注意的是，mNGS在链球菌的检测方面具有明显的优势，在所有六个病例中的所有三种类型标本中均检测到，而培养法仅在三个病例中检测到。此外，mNGS还能检测出从培养中难以检测到的病原体，如痤疮丙酸杆菌、支原体和病毒。总体而言，就病原体检出率而言，三种标本的mNGS均高于相应类型标本的培养。与假体周围组织和滑液相比，假体超声裂解液的mNGS的病原菌覆盖率最高(84.6%)。值得注意的是，mNGS检测多种病原体引起的感染比培养法更好(10例对1例)。
表3. 在三种类型的标本中通过宏基因组二代测序和培养检测的病原体。
mNGS：宏基因组二代测序；PSF：假体超声裂解液；PT：假体周围组织；SF：滑液。
以前接受过抗生素治疗的患者可能会在培养检测病原体时受到抗生素的影响。mNGS在这些患者中表现出不同的检测特性，在以前接受抗生素治疗的9名患者中，有8名患者检测到病原体，而培养只在5名患者中检测到病原体(表4)。在31例未用过抗生素的患者中，mNGS的敏感性(96.8%)与培养的敏感性(93.5%)无显著性差异。
表4. 接受或不接受抗生素治疗的患者人工关节假体周围感染的宏基因组二代测序和培养的检测特征。
假体超声裂解液的mNGS大多优于其他两类标本的mNGS。在临床实践中，假体超声裂解液可能是治疗mNGS的最佳单一选择。此外，mNGS与培养相结合可能是优化病原菌检测的途径。因此，当使用多个样本时，该研究根据结果探索了mNGS和培养相结合的有效性。如表5所示，mNGS和培养的组合对所有三种类型的标本都有最高的敏感度95.0%(38/40)和最高的检测率100%(52)。对于mNGS联合单样培养，mNGS和假体超声裂解液培养的敏感性最高（95.0%），检出率最高为94.2%(49/52)。然而，mNGS与培养的结合并不明显优于单独使用假体超声裂解液的mNGS(敏感度95%vs92.5%)。
表5. 宏基因组二代测序和培养的组合应用。
结论
3
mNGS可以作为一种准确的诊断工具，使用三种不同类型的标本来检测PJI中的病原体。由于其优越的诊断性能，与其他类型的标本相比，假体超声裂解液中的mNGS发挥了更大的作用，并有可能部分取代传统的检测方法，如培养。此外，本研究使用了三种类型的标本，有助于改进mNGS技术的处理和分析，使其在这些患者的病原体鉴定中得到深入的应用。
END
南京诺因生物科技有限公司总部坐落于江苏省南京市江北新区生物医药谷，专注应用领先的基因技术助力临床感染病原的诊疗，诺因（KnoinDX）取 “Know Infection Through GeneTech（通过基因科技破解感染）”的含义，寓意企业的宗旨是应用基因科技帮助医生破解病原体感染的难题。
