在癌症治疗的征途上，免疫疗法以其激发机体自身抗肿瘤能力而备受瞩目。然而实体肿瘤中的免疫抑制微环境严重限制了其疗效。为了打破这一局限，科学家们一直在寻找能够改善肿瘤微环境并增强免疫应答的新策略。在肿瘤中诱导免疫原性细胞死亡（ICD）可以通过释放免疫刺激性成分来增强实体瘤的免疫疗法反应。其中MLKL介导的坏死性凋亡已被证明能够引发强大的抗肿瘤免疫反应，使其成为癌症治疗的一个有吸引力的靶点。然而将诱导ICD的成分安全有效地传递到肿瘤部位仍然是一个挑战。来自比利时鲁汶大学的研究者在Advanced Healthcare Materials (IF=10)上发表最新研究成果，研究者开发了一种新型HPAEs纳米材料递送系统，用于将MLKL质粒DNA高效递送至肿瘤，增强免疫反应，与PD-1抗体联合使用能显著改变肿瘤微环境，提高小鼠生存期。这一系统有望成为提升癌症免疫疗法效果的新策略。
在这篇文章中IsoLight单细胞功能蛋白质组学分析系统被用于评估HPAE-MLKL诱导的免疫反应，特别是对T细胞活化和细胞因子分泌的影响。这些分析为研究者提供了对免疫反应的深入理解，帮助研究者评估HPAE-MLKL作为一种新型免疫疗法的潜力和效果。
研究亮点
纳米材料递送系统：本研究开发了一种新型的高分支聚𝛽-氨基酯（HPAEs）纳米递送系统，专门用于将携带MLKL基因的质粒DNA高效传递至肿瘤细胞，为免疫疗法提供了新的工具。
免疫原性细胞死亡（ICD）的诱导：通过MLKL质粒的递送，成功诱导了肿瘤细胞的免疫原性坏死，这一过程能够激活强烈的抗肿瘤免疫反应。
单细胞分泌蛋白组技术应用：利用IsoCode小鼠先天免疫芯片，研究者深入分析了T细胞的活化状态和多功能性，揭示了HPAEs-MLKL诱导的免疫反应的有效激活。
主要研究成果
HPAEs的制备、表征以及质粒递送的条件优化
研究人员详细描述了高度分支的聚𝛽-氨基酯（HPAEs）的制备过程和特性分析。这些聚合物通过“A2 + B3 + C2”迈克尔加成策略合成（图1-1）。核磁共振波谱和凝胶电泳证明HPAEs展现出高效DNA结合能力。TEM分析揭示了HPAEs-pDNA复合物具有均匀的纳米尺寸和正的表面电荷，有助于细胞摄取（图1-2）。研究人员还确定最佳的HPAE:pDNA比例。这些结果表明HPAEs作为一种新型的非病毒基因载体，具有高效递送MLKL质粒DNA至肿瘤细胞的巨大潜力，为癌症免疫治疗提供了新的策略。
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图1. HPAEs传递MLKL的示意图以及对HPAEs和HPAEs-pDNA的表征
体外实验证明MLKL质粒对肿瘤细胞的杀伤和免疫激活功能
研究人员评估了MLKL pDNA通过HPAEs传递至CT26肿瘤细胞后的毒性，发现其具有随时间增强的显著毒性。进一步研究表明，MLKL pDNA能显著上调MLKL蛋白表达，触发细胞坏死的关键步骤，包括MLKL蛋白磷酸化、寡聚化和向细胞膜的转位。此外，MLKL诱导的细胞死亡显示出免疫原性，通过提升MHC-I和Calreticulin水平，增强了肿瘤细胞的抗原呈递能力，从而可能加强抗肿瘤T细胞反应。于是，研究者进一步使用布鲁克的IsoLight系统探索HPAE-MLKL对T细胞功能的影响。
实验方法：在体外实验中，研究者将肿瘤细胞与HPAE-MLKL纳米复合物共培养，移除培养基后，让细胞在新鲜培养基中继续孵育。然后，使用收集到的上清液来刺激新鲜分离的树突细胞。随后，这些DCs被与新鲜分离T细胞共培养24小时。T细胞通过FACS分选后，使用IsoLight系统和IsoCode 小鼠先天免疫芯片对单个细胞的细胞因子分泌水平进行了分析。
实验结果：多功能强度指数（PSI）分析证实，与对照组相比，HPAE-MLKL处理组的多功能细胞数量增加了四倍。此外，多功能性PAT-PCA分析显示，治疗组的T细胞表现出包括Granzyme B、IL-15、IL-1β、IL-27、IL-4、IL-6、IFN-γ、TGF-β、IL-17A在内的多功能性亚群。这些发现表明，HPAE-MLKL处理有潜力促进CD4+和CD8+ T细胞的分化和扩增（图2）。
图2. HPAE-MLKL诱导的免疫反应
总之，HPAE-MLKL的体外转染结果表明，它能够诱导坏死性细胞死亡，并激发能够促进CD4+和CD8+ T细胞激活的有力抗肿瘤免疫反应。这些发现突出了HPAE-MLKL复合物作为肿瘤治疗潜在免疫治疗策略的巨大潜力。
小鼠模型证明HPAE-MLKL复合物抗肿瘤和降低远端转移的作用
研究人员发现HPAE-MLKL复合物能有效激活针对同种异位乳腺腺癌的保护性树突细胞（DCs），引发强烈的抗肿瘤免疫反应，延缓肿瘤生长。MLKL激活的DCs显著提高了肿瘤微环境中免疫细胞的浸润，特别是CD4+和CD8+ T细胞。此外，HPAE-MLKL与抗PD-1的联合治疗能显著提高抗肿瘤效果，将“冷”肿瘤转变为对免疫疗法敏感的“热”肿瘤。研究还证实了该联合疗法能激活全身性免疫反应，减少肿瘤转移风险（图3），并在患者来源的三阴性乳腺癌类器官中显示出潜在有效性，为癌症治疗提供了一种新的策略。
图3. anti-PD-1与HPAE-MLKL联合疗法显著降低肿瘤转移水平
总结
本研究通过使用高度分支的聚𝛽-氨基酯（HPAEs）作为非病毒基因载体，成功地将编码MLKL的质粒DNA局部递送到肿瘤中，以此增强了肿瘤对免疫检查点阻断剂（如PD-1抗体）的敏感性，并显著减少了肿瘤转移。HPAEs的使用不仅提高了MLKL pDNA的稳定性，避免了酶降解，而且通过其高度正电荷的特性，增强了与肿瘤细胞膜的静电相互作用，促进了细胞摄取。MLKL介导的坏死能够促进免疫细胞对肿瘤的浸润，激活了针对肿瘤抗原的T细胞反应。与抗PD-1的联合治疗不仅重塑了肿瘤微环境，增加了肿瘤内树突细胞和特异性CD8+ T细胞的数量，而且还显著提高了小鼠的生存率。此外，HPAEs-MLKL联合抗PD-1治疗在减少肿瘤生长和转移方面显示出了协同效应，这表明了一种新的肿瘤免疫治疗方法的潜力。
参考文献
Chu T, Maksoudian C, Pedrotti S, et al. Nanomaterial-Mediated Delivery of MLKL Plasmids Sensitizes Tumors to Immunotherapy and Reduces Metastases. Adv Healthc Mater. Published online July 19, 2024.
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