学术文章丨首创数字PCR法精准定量粪便中肺炎克雷伯菌

研究背景

肺炎克雷伯菌是一种常见条件致病菌，可引起多种疾病，并容易对大多数抗菌药物产生耐药性，使得治疗肺炎克雷伯菌引起的感染变得越来越困难。因此，早发现对于临床及时、快速诊断和有效治疗至关重要。传统的细菌培养检测方法速度慢、灵敏度低，难以满足要求。分子诊断技术的发展大大提高了病原体检测的效率。实时荧光PCR因其良好的敏感性和特异性已被用作检测病原体的日常诊断工具。然而，当目标病原体的浓度很低时，实时荧光PCR的准确性可能较差。此外，实时荧光PCR法每次对检测目标定量都需要用标准品来绘制一个标准曲线，这使得实验过程更加复杂和耗时。而且，不恰当的标准品可能会影响诊断的准确性。另外，肺炎克雷伯菌在相当比例的人群中（美国23%，亚洲18.8%-87.7%）是肠道的定植菌，是肠道疾病引发腹腔感染和血流感染的主要致病菌。对粪便中肺炎克雷伯菌的监控可以帮助减少传播。降低粪便中的各种杂质的影响是检测方法的关键。

数字PCR (Digital PCR，dPCR) 是一种新的单分子DNA检测技术，可以在不需要标准曲线的情况下准确定量目标核酸的绝对拷贝数。它是一种正在逐渐替代传统实时荧光PCR的微生物检测方法。在检测过程中，数字PCR会将反应混合物分离成数万个纳升级的反应液滴，然后在每个液滴中对目标核酸单独进行PCR扩增。扩增结束后，对反应终点的荧光阳性液滴和阴性液滴进行计数。因为目标核酸的数量与阳性液滴的数量呈正相关，利用泊松二项分布，可以计算目标核酸的绝对拷贝数。由于数字PCR具有较高的灵敏度和准确性，已广泛应用于许多实验室和临床各种传染病的诊断。

方法与结果

研究人员对比了数字PCR法与实时荧光PCR法的灵敏度以及对粪便中杂质的耐受度，还对比了数字PCR、实时荧光PCR和培养法对临床样本的阳性检出率。数字PCR在这些对比实验中都显示了更优良的性能。

一、数字PCR法与实时荧光PCR法灵敏度对比

数字PCR对肺炎克雷伯菌的检测下限达到了1.1拷贝/微升，与实时荧光PCR相比，灵敏度提高了10倍。此外，如下图所示，研究人员还观察到，在数字PCR检测中，检测结果的拷贝数和肺炎克雷伯菌的浓度存在很强的线性关系。

为了对比粪便中杂质对数字PCR和实时荧光PCR的检测效率的影响，研究人员将相同量的肺炎克雷伯菌ATCC BAA-2146的DNA与不同量的粪便样本提取物混合，制备检测样品，然后进行检测。结果表明，与实时荧光PCR相比，数字PCR对粪便样本提取物的耐受度更高，表现为受影响率相对较低。当加入每个检测反应体系中的粪便样本提取物达到6微升时，差距明显（#,P ≤0.05），见下图。

三、三种方法对临床样本阳性检出率的比较

研究人员分别用培养法、数字PCR法和实时荧光PCR法检测了103例临床样本，以培养法为基准对比了数字PCR法和实时荧光PCR法的检出率。结果见下图。

与培养法相比，数字PCR（ddPCR）法多检出16例阳性样本，临床灵敏度是100%，而实时荧光PCR漏检了1例阳性样本，临床灵敏度是98.8%。

四、数字PCR的重复性验证

此项研究中，研究人员还分别检测了数字PCR法的重复性（Repeatability）和再现性（Reproducibility），结果显示，在样本浓度从大于2000拷贝/反应到低至1拷贝/反应的范围内，数字PCR都显示了很好的重复性，见下表。

数字PCR是一种可以精准定量目标DNA绝对拷贝数的方法，而且在检测病原体方面比实时荧光PCR更敏感和更稳定。本研究证明，数字PCR可准确测定粪便样品中肺炎克雷伯菌的拷贝数，具有良好的特异性、敏感性、重复性和再现性，为粪便样本中病原体的精准检测做了极具价值的探索。我们祝袁静主任团队在利用数字PCR检测复杂临床样本中病原菌方面取得更多的成就，期待更多优秀论文的发表。

原文链接：

https://journals.asm.org/doi/10.1128/spectrum.04249-22