【流式研习社 2】同型对照：定义阴性边界的系统参照

在多色流式实验数据分析中，我们习惯于讨论阳性信号的强弱，却往往忽视了“阴性”的背景基线。同型对照（Isotype Control）提供抗体-样本体系的背景基线，用于评估非特异性结合与噪声；阈值/门限判定建议以 FMO 对照为准；补偿计算必须使用单染（Single-Stained）对照。合理的同型对照设置能揭示信号背后的噪声结构，从而判断真正的表达是否成立。

图1. 使用空白设门（红线）与用同型对照设门（蓝线）对比

从“零点”出发：同型对照的实验逻辑与意义

同型抗体与目标抗体在宿主来源、Ig 亚型及荧光素标记上保持一致，但缺乏对目标抗原的特异性结合能力。它提供一个抗体-样本体系的背景基准，用于评估非特异性结合和体系噪声。同型对照用于评估抗体-样本体系的背景与非特异性结合；阈值/门限判定建议以 FMO 对照为准；补偿计算必须使用单染（Single-Stained）对照。

当样本存在较强Fc受体、非特异性结合或自发荧光时，同型对照能揭示系统噪声水平，使“阳性”判断基于实验体系的稳定性，而非主观划线。更重要的是，同型信号能作为体系问题的“放大镜”：

• 评估Fc受体结合残留：若单核细胞或B细胞中信号升高，提示Fc阻断不足。

• 识别荧光染料的聚集或泄漏：部分高亮染料（如PE、PerCP-Cy5.5）背景水平差异较大。

• 验证胞内染色的完整性：固定/破膜后若背景显著增加，同型对照能揭示这一变化。

图2. CD45不同处理下染色结果（未阻断染同型对照，背景升高，提示FcR阻断不足；FcR阻断后背景下降）

理想与现实之间：同型对照的使用边界

理论上，只要同型抗体与目标抗体在物种、亚型、荧光素比例及浓度上完全一致，就能准确反映背景水平。但这在实践中几乎不可能完全满足。不同批次间的荧光素与蛋白的比例、抗体纯度等微小差异，都可能导致信号漂移。因此，同型对照虽有参考意义，却不应被绝对化使用。

在完成 FMO 设门、死细胞排除、充分 Fc 阻断与抗体滴定且目标抗原强表达/双峰明显时，可考虑不配同型对照。以下为决策参考：

✅ 低/中低表达、连续分布的抗原（阈值难判）

✅ FcR 高表达细胞（单核细胞、巨噬细胞、B细胞、粒系）

✅ 胞内染色/固定破膜（背景常上升）

✅ 样本经刺激/培养/冻融（体系噪声提升）

✅ 新面板验证/新批次抗体上线（做法定基线）

⭕ 阈值以 FMO 明确设定且阴阳分离度大

⭕ 目标抗原强阳/双峰明显

⭕ 已完成死细胞排除、Fc 阻断充分、抗体滴定达最佳

⭕ 有历史基线与质控记录可依

让信号更可信：实践中的优化与思考

即便保留同型对照，实验设计仍需兼顾体系背景的控制，以下为优化建议：

• 进行抗体验证与滴定：抗体量过多会导致阴性峰偏移、基底增宽，干扰阈值判断。滴定至最佳浓度，确保信号清晰。

• 关注非特异性结合来源：若同型信号偏高，优先使用与细胞种属匹配的Fc阻断剂（如人样本用人类IgG或专用Fc block），先阻断再加抗体。可使用含免疫球蛋白/血清的封闭液进一步降低背景。

• 配合活性染料排除死细胞：死细胞的非特异性染色极强，往往造成背景“假阳性”。使用胺反应性活性染料（如Zombie dyes），在表面染色前或上样前完成死细胞标记。

• 谨慎设定门限：同型对照仅反映抗体的非特异性结合，不能单独作为阳/阴性划分依据。光谱展宽（Spillover Spreading）需通过SSM/CSI指标结合单阳和FMO评估。

• 处理高自发荧光样本：组织、老年样本或髓系细胞需保留未染对照并尝试自发荧光校正通道/模型，同型对照仅覆盖抗体相关背景，无法替代自发荧光校正。

同型对照的匹配与滴定

严格匹配：宿主种属、Ig 亚类（如mouse IgG1 κ）、荧光素、偶联工艺/批次、缓冲体系尽量一致。

同量或同效量：与目标抗体同最终浓度/同质量，或滴定至目标抗体等效背景位移；避免“同型过量”导致假高背景。

条件一致：与全染同一固定/破膜流程、温度/时间、洗涤、阻断、电压/增益。

判读原则：同型MFI ≈ 未染MFI为理想；若同型显著高于未染，优先排查Fc阻断不足、抗体过量、死细胞残留。

同型对照的选择与应用实例

以下是一个单色流式实验中选择和应用同型对照的实例，用于检测人类外周血单核细胞（PBMC）中的IL-17A-PE-Cy7（胞内染色）表达。

1. 实验背景：IL-17A为低表达抗原，PBMC含FcR高表达细胞（单核细胞、B细胞），且涉及固定/破膜，需同型对照评估非特异性结合。仪器为BD FACSCanto II。

2. 同型对照选择：为IL-17A-PE-Cy7（mouse IgG1 κ，PE-Cy7标记，浓度1 µg/mL）选择同型抗体mouse IgG1 κ-PE-Cy7，来自同一供应商、批次，荧光素/抗体比例匹配，浓度调整至1 µg/mL（滴定确认等效背景位移）。

3. 实验流程：取约1×10^6个PBMC，先用Zombie Aqua（胺反应性染料）标记死细胞（4°C，15分钟），洗涤后用人类IgG（10 µg/mL）进行Fc阻断（4°C，10分钟）。随后加入mouse IgG1 κ-PE-Cy7同型抗体，4°C孵育30分钟，洗涤后按全染样本相同的固定/破膜试剂盒（eBioscience）处理。所有样本使用相同缓冲液、离心条件和PMT电压（预先通过CS&T质控校准），收集至少10,000个事件。

4. 结果与判读：同型对照在PE-Cy7通道的MFI约为200，与未染样本MFI（150）接近，表明背景低、Fc阻断有效。相比之下，全染样本中IL-17A+细胞MFI为2,000，阴阳分离清晰（SI≈20）。若同型MFI显著高于未染（如500），则需检查Fc阻断剂量、死细胞比例或抗体浓度。FMO对照用于确认IL-17A门限，单阳对照（若涉及多色扩展）用于生成补偿矩阵。

这个例子展示了如何为单色实验中低表达抗原选择同型对照，强调严格匹配（种属、亚型、荧光素）、滴定一致、Fc阻断和死细胞排除的重要性，确保背景信号可信，为阈值设定提供参考。

同型对照为流式实验提供了重要的背景参照。它能够反映非特异性结合水平，帮助研究者识别体系噪声，从而提高信号判读的准确性。实验中需结合实验目的和样本特性灵活判断，合理设置同型对照，能有效提升数据的稳定性与可信度，为实验结果提供更科学的支撑。