免疫实验全拆解｜第1期 WB 实验你做对了吗？别再让条带“跑偏”！

Western Blot 是一种经典的蛋白检测方法，广泛用于确认特定蛋白的存在及其相对表达量。其原理基于蛋白质的分子量分离和抗体特异性结合，主要步骤包括：

蛋白提取与定量：从细胞或组织样本中提取总蛋白，并使用BCA或Bradford法进行浓度测定；

SDS-PAGE 电泳：通过加SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白变性并带上均匀负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中按分子量大小分离；

转膜：利用电场将分离后的蛋白从凝胶转移到PVDF或NC膜上，保留蛋白的空间分布；

抗体孵育：使用特异性一抗结合目标蛋白，再用标记有酶（如HRP）或荧光染料的二抗结合一抗，形成信号放大系统；

显色或发光检测：通过酶促反应（如ECL化学发光）或荧光信号，检测目标蛋白的位置和表达量。

WB的原理依赖于SDS-PAGE分离蛋白的能力以及抗体的特异性识别，确保对目标蛋白的精准检测。它是科研中不可或缺的技术之一，帮助分析蛋白表达水平、修饰状态及抗体特异性。通过优化操作，可获得高精度、可靠的实验数据。

如果 WB 中的条带偏移，问题往往出在这些方面：

上样太多：上样量过多时，蛋白无法正确分离，导致条带“堆积”在一起，无法清晰呈现；

胶没聚好：如果电泳时胶的聚合不均匀，蛋白会跑得不均匀，导致条带形状扭曲；

转膜起泡：转膜过程中，如果膜上有气泡没有及时排出，蛋白转移不完全，条带可能出现断裂或模糊。

上样量控制在 20–30 μg，确保蛋白清晰分布；

确保胶聚合良好，可以通过反复检查胶的完整性来避免跑歪；

使用滚轴转膜，仔细确保没有气泡。

Fig.1.条带跑偏 vs 正常条带示意图

高背景的 这个现象常常让人误以为是洗膜不彻底，但很多时候，真正的原因是：

抗体浓度太高：抗体浓度过高可能导致背景信号的增强，掩盖目标蛋白的真实信号；

封闭剂选择不当：如使用奶粉等封闭剂时，可能会干扰某些特定系统的信号；

二抗过度反应：二抗浓度过高，增强信号效果时可能产生过多背景。

一抗和二抗浓度一定要做预实验，不要仅凭感觉；

封闭剂选择 BSA，这种封闭剂对背景较低，且稳定性好；

曝光时，先拍一张长曝光图，从中找到最佳曝光时间。

Fig.2.背景模糊 vs 清晰图像对比图

如果你遇到信号弱的情况，可能并不是抗体的问题，可能是这些方面没有注意到：

一抗浓度过低：一抗浓度过低时，靶标蛋白信号可能被忽视，导致条带弱；

转膜失败：如果转膜没有完成，蛋白就无法从凝胶成功转移到膜上，信号自然也无法显现；

曝光时间不够：曝光时间过短，可能导致信号没有充分显现。

确保 PVDF 膜提前活化，有助于提高膜的吸附性；

转膜的电压和时间根据目标蛋白的分子量进行匹配；

曝光前拍一张长曝光的“预判图”，找到最合适的信号范围。

Fig.3.梯度稀释 WB 条带图

以下是一些容易被忽略的细节，可能会直接影响实验结果：

目标蛋白的表达量：如果目标蛋白是低表达型，需要通过富集或延长曝光时间来增强信号；

识别天然构象还是变性蛋白：Western Blot 只适合变性蛋白的识别；

膜的选择：PVDF 膜对于较大分子量蛋白的转膜效果更好，而 NC 膜适用于一些低分子量蛋白。

Western Blot 实验没有一个“标准答案”，每一个环节的优化都能让结果更清晰。通过细化每一个步骤，优化抗体浓度、转膜时间等因素，你可以逐步获得稳定且可重复的实验结果。

组织背景过深？信号不清楚？自发荧光干扰大？我们将带你一步步拆解免疫组化实验中的“误区”，敬请期待！