抗体太烧脑?交给abinscience,一期一拆解!｜蛋白实验从源头抓起：样本裂解与定量指南- 大数跨境

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抗体太烧脑?交给abinscience,一期一拆解!｜蛋白实验从源头抓起：样本裂解与定量指南

艾必赛生物

2025-07-31

导读：在蛋白表达研究中，无论是Western blot、免疫沉淀（IP）还是质谱分析，样本处理都是影响结果准确性的第一道关口。从裂解方法的选择、抑制剂的添加，到后续的蛋白定量手段，每一步都需要精准把控，才能

艾必赛知识问答第五期

样本裂解与定量指南

前言

在蛋白表达研究中，无论是Western blot、免疫沉淀（IP）还是质谱分析，样本处理都是影响结果准确性的第一道关口。从裂解方法的选择、抑制剂的添加，到后续的蛋白定量手段，每一步都需要精准把控，才能为后续的信号检测与数据解读打下坚实基础。

为什么蛋白裂解这么重要？

不同细胞或组织的结构差异显著，蛋白质定位也各不相同。细胞膜、核膜、胞器膜等结构对蛋白提取形成天然屏障，若裂解方法选择不当，不仅提取效率低，蛋白降解与变性风险也大大增加。特别是在研究膜蛋白、磷酸化蛋白或瞬时信号激活等课题时，对样本完整性的要求更为严苛。

Fig.1.样本裂解过程示意图

(doi.org/10.3390/mi8030083)

经典RIPA裂解液配方与操作建议有哪些

RIPA（Radio Immunoprecipitation Assay）裂解液因其兼具裂解力与蛋白保留能力，在总蛋白提取场景中应用广泛。适用于细胞裂解、组织匀浆样本的常规Western blot、免疫共沉淀（IP）及部分功能性蛋白分析。

常规RIPA裂解液配方

成分	浓度
Tris-HCl（pH 7.4–7.6）	50 mM
NaCl	150 mM
NP-40 或 Triton X-100	1%
Sodium deoxycholate	0.88%
SDS	0.10%

使用前需现配添加以下抑制剂以提升裂解效果和蛋白稳定性：

1 mM PMSF（抑制丝氨酸蛋白酶）

1 mM EDTA（螯合金属酶活性）

蛋白酶抑制剂混合物（如E64、pepstatin A）

磷酸酶抑制剂：NaF、Na₃VO₄（如需保护磷酸化位点）

Fig.2.RIPA裂解液组分图

裂解操作注意事项有哪些？

操作阶段	建议说明
裂解前	样本需预冷，器材提前冰浴预冷；保持裂解液新鲜现配
裂解中	操作全程冰上，防止蛋白酶激活降解目标蛋白
裂解后	高速离心（如12,000 rpm, 10 分钟, 4°C），取上清，尽快进行定量和上样
特殊样本	对于膜蛋白、核蛋白、线粒体蛋白，建议选用专用裂解液并根据目标定位调整方案

蛋白定量方法简述：BCA vs Bradford

在蛋白裂解完成后，准确定量是保证上样一致性与后续分析可靠性的关键一步。以下为常用蛋白浓度检测方法对比：

方法	原理	优势	注意事项
BCA 法	铜离子还原 + Bicinchoninic Acid 络合反应，在562 nm处显色	抗干扰性强，适配多种裂解液，结果稳定	对还原剂、螯合剂部分敏感，需控制浓度
Bradford 法	染料与蛋白结合，引起波长迁移	快速、灵敏、操作简便	对SDS等干扰敏感，适用性较窄

Fig.3.蛋白定量方法选择图(10.1039/C4AN01819B)

典型错误示例与优化建议有哪些

问题表现	原因分析	优化方案
样本条带模糊、拉丝	裂解不充分、蛋白降解	延长裂解时间，添加抑制剂并全程冰浴操作
上样量差异大、结果不一致	未定量或浓度偏差大	统一BCA定量方法，建议重复两次检测取平均
膜蛋白检测信号弱	RIPA裂解力不足	替换为Triton X-100高浓度裂解液或膜蛋白专用Buffer

Fig.4.裂解失败案例

结语

蛋白表达实验成败的第一步，始于样本裂解和定量环节。标准化的裂解流程与合理的Buffer选择，不仅能提升目标蛋白保留率，也为后续抗体检测与数据分析奠定基础。建议实验者根据研究目的灵活调整裂解策略，结合定量方法双重把关，共同守好蛋白分析的“入口关”。abinScience提供高品抗体产品，支持您的实验需求。