免疫实验全拆解｜第3期：ELISA，你的实验结果稳定吗？

酶联免疫吸附试验（ELISA，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种高灵敏度的检测技术，利用抗原与抗体的特异性结合，在微孔板上检测样本中的目标抗原或抗体。其原理基于酶促反应放大信号：一抗特异性结合目标分子，标记有酶（如HRP或ALP）的二抗进一步结合一抗，通过底物反应产生可测量的颜色或荧光信号。ELISA广泛应用于疾病诊断（如病毒检测）、生物标志物定量和科研中蛋白质浓度的测定，因其高通量、灵敏度高和操作简便而受到青睐。

ELISA根据检测方式的不同，可分为直接法、间接法和竞争法，以下表格对比了它们的主要特点：

ELISA 主要通过抗原与抗体的特异性结合，配合酶的催化反应来实现信号放大。在操作过程中，如果出现任何环节的疏漏，都会影响最终结果。标准 ELISA 实验通常分为以下几步：

• 板 coating：将已知抗原涂覆在微孔板上，作为检测对象；

• 封闭：用封闭液封闭微孔板，避免非特异性结合；

• 加入样本：加入待测样本，靶标抗体与抗原结合；

• 加入二抗：加入与一抗结合的标记二抗，进行信号放大；

• 显色反应：通过酶底物反应产生可视化信号，最终读取结果。

如果实验的结果波动较大或不稳定，常常是由于以下原因：

• 标准曲线不准确：有时候样本和标准品的吸光度不在同一量程内，导致数据对比困难；

• 底物反应不均：底物的添加时间、浓度不一致，或者样本的处理不当，都会导致信号不均匀。

• 确保每个样本的处理过程一致，尽量减少人为误差；

• 做好标准曲线的制作，确保标准品和样本的吸光度在同一量程内；

• 使用推荐的底物浓度和反应时间，避免过度反应导致背景染色。

高背景信号常常会干扰真实的检测信号，导致实验结果不准确。背景信号通常是由非特异性结合造成的，比如：

• 封闭不充分：封闭液没完全封闭微孔板，导致非特异性结合。

• 抗体浓度太高：过高的抗体浓度容易导致非特异性结合，从而加大背景信号。

• 使用合适的封闭液，如 BSA、奶粉等，避免封闭不充分；

• 严格控制抗体浓度，避免过高导致背景信号。

显色反应时间过快或者过慢都会影响实验的准确性，影响最终的吸光度值。如果显色反应过快，可能会导致信号过饱和；如果显色过慢，可能会导致信号过弱，难以检测。

• 试验前做好预实验，设置合适的反应时间，通常可以通过梯度反应实验来找到最佳的显色时间；

• 注意控制温度和底物浓度，确保反应在最佳条件下进行。

洗涤过程不彻底，会导致未结合的试剂残留在孔中，从而干扰信号的读取。

• 确保每个步骤的洗涤过程都彻底，尤其是加入二抗后，需要多次清洗，以去除未结合的抗体。

根据实验的目的，优化每一个细节可以显著提升实验的稳定性和准确性：

• 根据目标物质的浓度范围，选择适合的标准品；

• 确保标准品浓度梯度合适，避免过高或过低的浓度范围。

• 一抗和二抗的浓度不要过高或过低，推荐通过预实验来确认最佳浓度；

• 选择合适的封闭液，减少背景干扰。

• 进行多重复实验，确保数据的一致性和可靠性；

• 进行空白对照，帮助排除干扰信号。

图例建议：

标准曲线对比图(不同条件（NaCl浓度、甲醇浓度、pH值、物种来源）对ELISA标准曲线的影响）

ELISA实验虽然简单易懂，但在细节上常常容易出错。只要在操作过程中严格把控每一步，优化关键参数，你就能获得稳定、可靠的实验数据。

流式实验中常见的偏差问题和如何规避，让你无缝切换到更精准的实验模式！敬请期待。