Communications Biology | 全基因组整合分析揭示WIP蛋白在抑制生长发育中的作用

在葫芦科中，CmWIP1是控制性别决定的主要基因。为了使人们对CmWIP1的功能有新的认识，作者研究了两个拟南芥WIP转录因子AtWIP1 / TT1和AtWIP2 / NTT。使用诱导表达系统，作者证明了WIP是强大的生长抑制剂和细胞死亡诱导剂。通过ChIP-seq和RNA-seq整合分析，则揭示了WIP结合的大多数上调基因都包含W-box基序，与应激信号相关。相反，下调的基因包含GAGA基序，GAGA基序是多聚抑制复合体的已知靶标。为了验证WIP蛋白在抑制生长中的作用，作者在心皮原基中表达了AtWIP1 / TT1，并获得了雄花，模仿了甜瓜中的CmWIP1功能。使用其他启动子，进一步证明了WIPs可以触发营养和生殖器官的生长停滞。作者的数据支持WIP在招募控制生长和适应应激基因网络中的进化保守作用。

1、 WIP基因在拟南芥和甜瓜中的功能注释

对拟南芥和甜瓜之间WIP基因的保守性分析显示，来自甜瓜的两个WIP蛋白（MELO3C004740和MELO3C003009）与TT1聚在一起，而CmWIP1和其他三个相关蛋白（MELO3C009657，MELO3C023544和MELO3C009030）是NTT进化枝的一部分。另外，对拟南芥和甜瓜之间WIP蛋白功能研究。利用转基因植株35S:CmWIP1、35S:TT1和35S:NTT，观察到相似的表型，结果表明与拟南芥的直向同源物TT1和NTT相比，拟南芥中的CmWIP1启动了相同的分子过程。

根据先前的报道，为了测试CmWIP1是否能够在种皮发育中履行AtWIPs的功能，作者在tt1突变体的TT1启动子（2 Kb）下表达了CmWIP1的编码序列，同时在tt1突变体中在其自身的启动子（2 kb）下表达了TT1的编码序列来作对照。最终，作者发现CmWIP1在拟南芥中能部分代替TT1的功能。

综上，在甜瓜和拟南芥之间，WIP蛋白共享保守的蛋白结构和功能。因此，对拟南芥中WIP蛋白的表征可能会为理解甜瓜中WIP蛋白的功能带来新的见解。

图1 拟南芥和甜瓜中的WIP转录因子

2、 WIP结合位点的全基因组鉴定

对TT1和NTT的共有结合位点motif分析。前三个最显著的结合基序被确定为GAGA-repeat，bZIP（ABI5）和W-box（WRKY）基序。

图2 WIPs结合位点的全基因组鉴定

3. WIP蛋白早期靶基因的鉴定

对Dex:TT1、Dex:NTT和Dex:GR进行RNA-seq分析，共鉴定到3538个（Dex:TT1 vs Dex:GR）和3188个（Dex:NTT vs Dex:GR）DEGs，两组差异共有1363个DEGs，其中761个上调表达，602个下调表达。

为进一步确认WIP主要靶标，联合DEGs和ChIP-seq结合峰，两个数据集有明显重叠。推定的TT1靶基因中，上调靶基因872个（占DEGs的24%），下调靶基因687个（占DEGs的19%）；NTT靶基因中，下调靶基因870个（占DEGs的27%），上调靶基因701个（占DEGs的21%）。所有这些数据共同表明，WIP蛋白可以充当转录激活因子或阻遏因子。

对TT1和NNT靶基因的motif分析发现，绝大部分TT1（37%）和NTT（22%）上调靶基因都含有TTGACY W-box（WRKY）基序；相反，绝大部分TT1（27%）和NTT（33%）下调靶基因含的是GAGA-repeat基序。

总之，RNA-seq和ChIP-seq的整合分析揭示了WIP TF的作用机制，其与GAGA基序的相互作用会抑制促进生长和发育相关基因的表达；而与W-box基序的相互作用，则会激活与应激信号通路相关的基因的表达 。

图3 WIPs的ChIP-seq和RNA-Seq数据的整合