导语：
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特点：特异性结合真核mRNA的3'端Poly(A)尾。 -
影响：如果您的RNA-seq文库构建主要采用多聚T引物，它会高效富集带有Poly(A)尾的mRNA。然而，对于那些Poly(A)尾缺失、很短或不完整的mRNA转录本（例如，某些组蛋白mRNA，或在特定生理条件下，Poly(A)尾被缩短的mRNA），多聚T引物将无法有效捕获。 -
差异产生：如果RT-qPCR为了提高逆转录效率或应对可能的RNA降解，采用了随机引物进行逆转录，那么这些在多聚T引物RNA-seq中被“遗漏”或低估的转录本，就有可能在RT-qPCR中被检测到，从而导致趋势不符。
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特点：随机结合RNA模板的任何位置，能逆转录所有RNA种类（包括mRNA、rRNA、tRNA等）。 -
影响：随机引物能提供更全面的cDNA文库，尤其适用于降解的RNA样本。但如果没有预先去除rRNA，大量的rRNA-cDNA会占据测序资源，降低目标mRNA的测序深度。 -
差异产生：如果RNA-seq采用多聚T引物，而RT-qPCR使用随机引物，且目标基因恰好是Poly(A)尾不完整或降解严重的mRNA，也可能出现差异。
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问题所在：RNA极易降解，降解通常从3'端开始。 -
多聚T引物RNA-seq的影响：如果RNA样本存在一定程度的降解，mRNA的3'端Poly(A)尾会受损。此时，依赖Poly(A)尾的多聚T引物逆转录效率会大幅下降，导致降解mRNA的表达量在RNA-seq数据中被严重低估，甚至检测不到。 -
RT-qPCR的影响：如果RT-qPCR在逆转录时添加了随机引物，即使RNA发生降解，随机引物也能从RNA片段的内部启动逆转录，从而更有可能检测到降解样本中基因的真实表达水平。这会使得RNA-seq（尤其是Poly(A)引物）与RT-qPCR（尤其是随机引物）的结果不一致。
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问题所在：多聚T引物从mRNA的3'端开始合成cDNA。如果转录本非常长，或者逆转录酶在合成过程中脱落，cDNA的5'端序列就可能合成不完整或缺失。 -
RNA-seq的影响：依赖多聚T引物的RNA-seq文库，其测序读段（reads）会呈现出3'端偏好性，即转录本3'端覆盖度高，而5'端覆盖度低。 -
差异产生：如果您在RNA-seq中筛选出的差异基因，其RT-qPCR引物恰好设计在转录本的5'端区域，那么在3'端偏好的RNA-seq数据中，这个基因的表达量可能被低估（因为5'端读段少），但在RT-qPCR中却能被正常检测到，从而导致结果不一致。
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如果qPCR引物设计在某个特定异构体特有的区域，那么它检测的只是该异构体的表达量。 -
如果RNA-seq检测到的是多个异构体的总表达量发生变化，但您qPCR引物只扩增其中一个异构体，且该异构体的表达趋势与其他异构体不同，就可能导致结果不符。 -
甚至，如果qPCR引物设计不佳，跨越了可变剪接区域，或者引物效率在不同异构体间存在差异，也可能影响结果的准确性。
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RNA-seq通常使用测序读段数量或FPKM/TPM值进行标准化。 -
RT-qPCR依赖选择一个或多个稳定的内参基因。如果选择的内参基因在实验条件下不稳定，或者两种方法使用的标准化策略不同，都会影响差异表达的计算和比较。
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仔细设计和验证qPCR引物，确保其特异性、高效性，并考虑引物位置（靠近5'端还是3'端）。 -
根据RNA样本质量和目标基因特性，灵活选择RT引物（多聚T、随机或GSP）。对于降解样本或关注mRNA的5'端区域，随机引物常是更好的选择。 -
选择稳定且经过验证的内参基因。
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