告别“黑白”，迎接“彩色”，荧光WB，你值得拥有

引

言

说起免疫印迹（Western Blot）检测，想必大家都很熟悉了，不就是WB吗？每天都做啊，白底黑带，但是最近经常阅读SCI文献（特别是高分的）小伙伴可能会发现，近两年发表很多高影响因子的文献的WB结果图发生了大变样：白底变成了黑底，条带从黑色变成了：红，橙，黄，绿，蓝等各种颜色了（如下），条带亮度，对比度都好了很多了，不同蛋白还能呈现出不同颜色的条带，很多同学可能会问，这是什么黑科技？是用分析软件设置的颜色吗？还是PS软件P出来的了？

尽管大多数生命科学研究者采用化学发光底物进行检测，但由于对多重分析的需求不断增加，现在越来越多的国外科学家开始使用荧光检测法。目前国内实验室使用较多的仍是化学发光，而SCI期刊中则有很多已经使用荧光标记WB了，为了紧跟时代的步伐，我们需要引进和创新。
 
常见Western Blot显色的方法主要有：放射自显影、底物化学发光ECL、底物DAB呈色，荧光WB实验步骤跟传统WB差异不大，最主要的差别在于二抗：传统WB检测二抗是酶标记，而荧光WB的二抗是荧光标记的，省去了繁杂的显影，照胶等步骤，取而代之的是利用荧光成像仪直接成像。

常规WB和荧光WB原理对比

化学发光的信号是动态的，二抗是酶标记，属于酶促动力学反应，信号随时间的变化而变化，信号不与目标蛋白浓度成线性比例关系。而荧光信号荧光是静态信号，不会随着时间的变化而变化，信号持久，可达到精准定量。

荧光免疫印迹已被证明比传统化学发光印迹更敏感，这是因为IR区域膜上的低背景荧光产生高的信噪比。配备有光电倍增管（PMT）的激光扫描成像仪对印迹进行成像，并可以将弱信号放大几个数量级。

使用双色检测方法可以同时检测相同印迹上的两种抗原。例如，您可以分析您感兴趣的蛋白，并利用内参蛋白（例如GAPDH，肌动蛋白）将其均一化，而无需剥离/重新检测印迹或运行单独的凝胶。因此，您的量化将更准确。

双色检测

为了确保可靠的定量测量，您从western blot获得的信号必须在线性动态范围内。这意味着信号强度与目标蛋白质丰度呈线性相关。换句话说，信号强度的两倍增加意味着目标蛋白质水平增加了两倍。通过激光成像仪获得的静态荧光值是定量的。这是因为荧光强度与几个数量级的蛋白质丰度成正比。这提供了广泛的线性范围。您可以在相同设置下量化低丰度和高丰度蛋白质，而不用担心信号饱和或超出线性范围。

相比之下，X射线胶片的动力学酶-底物反应和信号饱和将化学发光检测的线性度限制在更小的范围内。您经常需要尝试各种曝光以获得差异表达蛋白质的“正确图像”。这是为了确保捕获的信号在线性范围内。

荧光信号是仅取决于目标抗原的量的静态值，而许多变量影响通过膜曝光获得的化学发光信号。一些变量（例如，酶底物反应）难以控制导致不一致和不可重复的结果。Schutz-geschwender等（2004）报道了荧光蛋白印迹实验重复的标准偏差远远小于化学发光检测。因此，为了确保您的免疫印迹结果的重复性和准确性。

荧光信号非常稳定。您可以将您的印迹存储在冰箱中，并在您准备好后再进行成像。相比之下，如果您正在进行化学发光的免疫印迹，您通常需要马上开始成像。这是为了避免酶活性降低。

骨灰级传统WB玩家跑出来的条带应该也就左上角的水平了吧？相较于采用荧光WB随手一跑的结果（右上图和下图），如果你是审稿人，你会pick谁了？