超高灵敏度和特异性miRNA定量方法—

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超高灵敏度和特异性miRNA定量方法——双尾RT-qPCR

艾美捷

2021-04-09

越来越多的研究表明，miRNA是许多人类病理学中有潜力的诊断和预后生物标志物，但如果准确对miRNA进行定量检测一直是个难题。

传统的miRNA定量的试剂盒都是基于PCR法的，有没有基于PCR法的miRNA检测试剂盒呢，答案是肯定的，今天小艾给大家带来了升级版的基于PCR法的miRNA定量检测试剂盒——双尾RT-qPCR。

传统microRNA PCR检测法痛点

用传统的PCR法检测microRNA的挑战在于，两个常规PCR引物的总长度几乎是microRNA长度的两倍，因此不适合于做miRNA的引物。以前的技术通过使用发夹引物延伸microRNA，添加poly A尾巴或通过连接添加片段来解决这个问题，但是这会降低检测的灵敏度和特异性。此外，这些方法无法检测在3'末端修饰的microRNA，因为它会干扰延伸过程。

市面上常见的miRNA定量检测试剂盒原理

BioVendor专利产品

双尾RT-qPCR

我们专利的双尾RT-qPCR技术，具有独特的RT引物机制，与其他方法相比，可提供出色的灵敏度和特异性。双尾RT-qPCR技术已被开发用于总的miRNA和piRNA的定量。

双尾RT-qPCR原理

与使用单个结合探针不同，双尾PCR使用两个半探针，它们分别结合到不同的microRNA片段上，这些片段通过折叠的系链连接。虽然每个半探针本身都很短, 无法结合到microRNA上，但当两个半探针互补时，它们会协同结合，这种结合的特异性是非常高的，因为在短半探针中错配的影响非常大。然后可以使用两个特定序列引物对形成的cDNA进行PCR扩增，用SYBR进行检测。

双尾RT-qPCR优势

高灵敏度

最多少于10个分子

高特异性

适合于多种样本（血浆/血清，血液，组织等）中的miRNA检测和定量

通过折叠的系链连接的两个半探针（结合不同的microRNA片段）

动态范围广（高达9 log）

在进行单重qPCR之前，可进行双管多重RT-PCR

提供定制化服务

高灵敏度及特异性

5´互补片段显著提高分析的灵敏度：

5´互补片段显著提高检测的特异性：

5′-hemiprobe的特异性及灵敏度验证：为了测试5′-hemiprobe对特异性的贡献，我们比较了两种双尾RT引物区分Let-7 miRNA家族的两个成员：Let-7a和Let-7f的能力，它们仅有位于miRNA序列中心的单个核苷酸的差异。RT 1引物的5'-hemiprobe设计成与let-7a的5'-末端的前十个核苷酸结合，而RT 2引物的5'-hemiprobe结合在let-7a的8个核苷酸上，通过这种设计，区分let-7a和let-7f的核苷酸只是由RT 2引物的5′-hemiprobe检测的，而不是由RT 1引物检测的。RT 2引物的5′-hemiprobe也很短（8个核苷酸），因为我们认为探针序列较短时错配的影响会更加明显。其余的RT 1和RT 2引物序列以及所用的PCR引物是完全相同的。使用RT 2引物时，完全匹配和错配的模板之间的ΔCq（ΔCq= 11.07）显著大于使用RT 1引物（ΔCq = 4.66），不带有5′-hemiprobe的不同碱基重叠的RT 2引物，而不是不带有RT 1引物的RT 2引物。这证明了5'-半探针对系统特异性的重大贡献。值得注意的是，两种双尾RT引物完全互补的let-7a microRNA的Cq值相等，表明即使5′-hemiprobe的长度有两个碱基的不同，检测灵敏度仍然相同。

适用样本类型丰富


血浆/ 血清/ 尿液/ 脑脊液/ 生物液体	新鲜组织，冷冻／福尔马林固定组织的

细胞，外泌体

检测流程简便：

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