分子克隆

———让载体构建更简单

嘿，亲爱的科研工作者们，今天咱们要聊点高大上的——基因工程！

别紧张，我会用接地气的方式，带你走进这个神秘的世界，让你秒变“基因小达人”！

那么，基因工程、分子克隆和基因表达的基本概念、步骤、载体选择、表达鉴定及新技术应用。

这个过程到底是怎么玩的呢？别急，咱们一步步来！

基因工程，又称DNA重组技术，是在分子水平上对基因进行操作的技术。它涉及将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达。基因工程的基本步骤包括分子克隆和外源基因的表达。

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1、分子克隆定义

分子克隆是在分子水平上扩增特定DNA片段的方法，通过体外重组将目的基因插入克隆载体，再导入宿主细胞进行复制和扩增。

2、基本步骤

• 分：目的基因的分离和获取，包括从基因文库筛选、逆转录合成cDNA、从染色体DNA中分离等方法。

• 切：选择并线性化合适的克隆载体，常用限制性内切酶进行酶切。

• 接：目的基因与载体的连接，是分子克隆成功的关键步骤。

• 转：将重组质粒转化入大肠杆菌等受体细胞进行扩增。

• 筛：筛选阳性克隆，进行鉴定和纯化。

3. 载体选择

克隆载体：如质粒、噬菌体等，易复制、易提取，用于克隆目的基因。

表达载体：在克隆载体的基础上增加表达元件，使目的基因能表达。分为原核表达载体和真核表达载体（如酵母、哺乳细胞、昆虫细胞表达系统）。

穿梭载体：能在两种不同生物中复制，兼具克隆和表达功能。

1、抗生素筛选

在进行基因表达前，需进行抗生素敏感性实验，确定最佳筛选浓度。

2、载体转入细胞的方法

质粒转染：包括脂质体转染、电转染、磷酸钙沉淀等方法。

• 脂质体转染：操作简单，效率高，适用于多种细胞。

  
  

• 电转染：适用于难转染细胞，需特殊仪器和耗材。

  
  

• 磷酸钙沉淀法：条件苛刻，适用于易转染细胞。

病毒感染：使用慢病毒、逆转录病毒、腺病毒等，感染效率高，适合稳定表达株的筛选。

3.基因表达鉴定

通过荧光蛋白表达、QPCR（定量PCR）检测mRNA水平表达、WB（Western Blot）检测蛋白水平表达等方法鉴定目的基因的表达。

MI水平鉴定：通过荧光蛋白表达等直观判断。

蛋白水平鉴定：使用Western Blot（WB）检测蛋白表达。

间接检测：如通过检测microRNA的靶蛋白表达间接反映microRNA的表达水平。

4. 稳定表达株筛选

阳性混合克隆：筛选具有重组载体的细胞群。

单克隆筛选：挑选单个细胞进行扩增培养，确保遗传稳定性。

好了，今天的分享就到这里啦！是不是觉得基因工程也没那么难呢？希望今天的分享对你们有所帮助，拜拜啦！

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