【干货篇】PCR引物设计8大原则，科研小白必看干货！

//引物设计的目的

8大引物原则

确保引物的特异性：为确保PCR扩增的特异性，引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

选择合适的引物长度：寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度: Ln=2 (G+C)+(A+T)，Ln值能大于38,因为>38时, zui适延伸温度会超过TaDNA聚合酶的zui适温度(74℃)，因此无法确保产物的特异性。

确保产物不会形成二级结构：确保产物不会形成二级结构某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响。在选择扩增片段时，尽量避开二级结构区域。通过利用相关计算机软件判断mRNA的稳定二级结构,有助于优化模板的选择。

确保碱基的随机分布：在引物设计中,四种碱基的分布应保持随机性，避免出现聚嘌呤或聚嘧啶的现象。需特别注意,3’ 端连续的G或C数量不应超过3个,因为这样可能导致引物在G+C富集序列区发生错误引发。

确保G+C含量的合理性：G+C含量一般控制在40%~60%的范围内较为合适。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度通常比Tm值高出5~10° C。根据公式Tm=4(G+C)+(A+T)计算引物的Tm值，则有效引物的Tm范围为55~80℃。为使复性条件达到zui佳，引引物的Tm值宜接近72℃。

引物5’端可修饰/3’端不可修饰：引物的5’端限定了PCR产物的长度，但对扩增特异性影响较小。因此,对其进行修饰并不会影响扩增的特异性。引物5’端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、 Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一小段启动子序列等。

引物延伸始于3’端，不能对其进行任何修饰。此外,3’端不应存在形成二级结构的可能性。除了在特殊的PCR(AS-PCR)反应中引物3’端不能发生错配。

确保引物3’端避开密码子的第3位：引物的3’端应避开终止于密码子的第3位，因为密码子的第3位容易发生简并,这会对扩增的特异性和效率产生影响。

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