【干货篇】一篇文章，手把手教你小动物活体成像实验全流程，注意事项！

实验小知识|实验准则

质粒构建：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、超净工作台、恒温摇床 

细胞培养 ：CO₂培养箱、倒置显微镜、生物安全柜、离心机 

转染： 微量移液器、电动移液器

发光检测：多功能酶标仪

动物实验：小动物活体成像系统、异氟烷麻醉机、电子天平

病理分析：石蜡切片机、烤片机、荧光/正置显微镜或数字切片扫描仪    

质粒构建：质粒载体、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、PCR高保真酶、DH5α感受态细胞

细胞培养：DMEM/RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰酶-EDTA、PBS（无Mg²⁺/Ca²⁺）

转染与筛选：Arcegen Celthy脂质体或PEI40000、G-418、D-荧光素钠盐

发光检测：荧光素酶底物、细胞裂解液

动物实验：Matrigel、异氟烷或戊巴比妥钠

病理染色：4%多聚甲醛（PFA）、石蜡、HE染色试剂盒、IF/IHC/mIHC抗体及荧光二抗

细胞实验：6/12/24/96孔板、培养皿、冻存管、15 mL/50 mL离心管、1.5 mL EP管

动物实验：胰岛素注射器、无菌PBS、1 mL注射器、动物标记耳标

病理实验：石蜡包埋盒、载玻片、盖玻片、3 μm切片刀片

1、载体选择：pGL4.17-luc2-Puro（自带嘌呤霉素抗性，省时）

2、插入策略：CMV 强启动子驱动 luc2，保证高表达。

3、无缝克隆：推荐 Golden Gate 或 Gibson Assembly，阳性率＞90%

1、转染试剂：Arcegen Celthy 系列脂质体 C130002 或 PEI40000 C130009，24 h 效率可达 80-90%。

2、杀灭曲线（以 G-418 为例）：

第 0 天：96 孔板铺未转染细胞，20-25% 密度。

第 1 天：换含 0-1000 μg/mL G-418 的培养基，每 48 h 换液。

第 7-10 天：选最低全致死浓度（如 400 μg/mL）作为筛选浓度。

3、单克隆：极限稀释法 + 酶标仪发光检测，保留前 10% 高亮克隆。

1、发光-细胞数线性：将 1×10³-1×10⁵ 个细胞梯度铺板，R²>0.95 才算合格。

2、稳定性：连续传 30 代，发光下降 <20% 才可入库。

1、皮下瘤最快：5×10⁶ cells + 50% Matrigel，100 μL/只，5-7 天成瘤。

2、发光底物：Arcegen D-荧光素钠盐 C331502，15 mg/mL 无菌过滤，-20℃ 分装避光。
3、注射量：150 mg/kg（20 g 小鼠约 200 μL），腹腔注射 7-10 min 后上机。

4、麻醉：异氟烷持续吸入，避免戊巴比妥钠呼吸抑制。

1、常规 HE：看整体结构。

2、mIHC 七色：一张片同时标记肿瘤、血管、免疫细胞，直接关联活体信号。