高通量DNA甲基化芯片
实验步骤
导语
高通量DNA甲基化芯片
在癌症、神经退行性疾病等复杂疾病的表观遗传研究中，DNA甲基化作为基因表达的“开关”，其异常调控往往早于病理表现。高通量DNA甲基化芯片技术凭借百万级位点检测、单碱基分辨率的优势，已成为揭示疾病机制、发现生物标志物的核心工具。本文将从实验原理、目的到操作细节，为你提供一份可落地、避坑指南式的实验方案。
ONE
实验原理
⬇⬇⬇
DNA甲基化芯片的核心是亚硫酸氢盐处理+特异性探针杂交的双重技术，通过荧光信号量化甲基化水平。
案例参考：
在肝癌研究中，通过Infinium MethylationEPIC芯片发现，抑癌基因RASSF1A启动子区Beta值在肿瘤组织中较正常组织升高0.35（P=0.001），提示高甲基化可能抑制基因表达。
TWO
实验目的
从基础到临床的三大应用场景：
疾病机制挖掘
• 肿瘤研究：识别癌症驱动基因的甲基化异常（如结直肠癌中MLH1基因启动子高甲基化导致错配修复缺陷）。
• 神经疾病：解析阿尔茨海默病中APP基因甲基化与淀粉样蛋白沉积的关联。
生物标志物开发
• 早期诊断：通过血浆游离DNA甲基化图谱，实现肝癌的无创筛查（AUC>0.9）。
• 预后评估：乳腺癌患者中BRCA1甲基化水平与化疗耐药性显著相关。
药物机制研究
• 表观遗传药物筛选：检测DNMT抑制剂（如5-Azacytidine）对全基因组甲基化的重编程效应。
• 副作用评估：分析免疫检查点抑制剂是否诱导免疫相关基因的异常甲基化。
THREE
实验用品
细胞与生物样本
• 人永生化肝细胞系 L02
• 人肝细胞癌细胞系 Huh7
主要试剂与试剂盒
• DNA 提取试剂盒
• 亚硫酸氢盐转化（甲基化修饰）试剂盒
• Infinium Human Methylation 450 K BeadChip 芯片及配套杂交
• 扫描试剂
（DNA 提取试剂盒）
（ 亚硫酸氢盐转化试剂盒）
主要仪器与软件
• NanoDrop 核酸蛋白分析仪 —— DNA 浓度与纯度测定
• Eppendorf 微量离心管及常规离心设备 —— 样品分装与离心
• iScan 芯片扫描仪 —— 450 K 芯片荧光信号扫描
• GenomeStudio Methylation Module v1.9 软件 —— 原始数据读取、β 值计算及差异甲基化初步分析
（核酸蛋白分析仪）
（离心机）
FOUR
实验步骤
1
细胞培养与样本准备
将人永生化肝细胞 L02 和人肝细胞癌细胞系 Huh7 复苏后，分别接种于含 10 % FBS 的 DMEM 培养基，37 °C、5 % CO₂ 培养至对数生长期。
PBS 洗涤 2 次，0.25 % 胰酶消化，收集 1 × 10⁶ 个细胞/样本，PBS 重悬后 1 000 × g 离心 5 min，弃上清备用。
2
基因组 DNA 提取
按 QIAamp DNA Micro Kit 说明书，在 1.5 mL Eppendorf 管中裂解细胞并过柱纯化。
用 50 µL AE 缓冲液洗脱，获得基因组 DNA。
NanoDrop 测定浓度及 OD₂₆₀/OD₂₈₀，仅保留 1.7–2.0 之间样本；不合格者重新提取。
3
亚硫酸氢盐转化（甲基化修饰）
取 500 ng 合格 DNA，按沈阳百创特甲基化修饰试剂盒操作：
• 变性 98 °C 10 min → 亚硫酸氢盐处理 60 °C 2 h → 纯化柱回收。
终体积 20 µL，转化后 DNA 立即使用或 –20 °C 保存。
4
Illumina Infinium
450 K BeadChip 实验
全基因组扩增：将 4 µL 转化后 DNA 与 MA1、MA2 混合，37 °C 20–24 h。
片段化： 加入 FMS 37 °C 1 h 酶切片段化。
沉淀与重悬：加入 PM1 和 2-丙醇沉淀 DNA，离心弃上清，加入 RA1 重悬。
芯片杂交：
• 取重悬 DNA 与 HM 杂交缓冲液混匀，95 °C 20 min 变性；
• 每样本 10 µL 上样至 450 K BeadChip 反应室，48 °C 16–24 h。
单碱基延伸与染色：依次加入 XStain BeadChip 试剂盒中的延伸、染色、稳定化试剂，室温/37 °C 按手册执行。
扫描： iScan 系统扫描芯片，生成 .idat 原始文件。
5
数据处理与差异甲基化分析
使用 Illumina GenomeStudio Methylation Module v1.9 读取 .idat 文件，导入 manifest 文件，计算 β 值：
β = M / (M + U + 100)。
导出 β 值及检测 P 值矩阵。
差异甲基化位点（DMP）筛选：
①empirical Bayes moderated t-test（limma），Bonferroni 校正；
②校正后 P (adj. P) ≤ 0.05 且 |Δβ| ≥ 0.2；
③CpG 覆盖度 ≥ 95 %。
进一步高置信度过滤：
• adj. P ≤ 0.05 且 P ≤ 1.06 × 10⁻⁷；
• 高甲基化：Δβ > 0.2 且 L02 β < 0.25；
• 低甲基化：Δβ < –0.2 且 Huh7 β < 0.25。
结果导出：显著差异 CpG 列表用于后续 GO/KEGG 及网络分析。
FIVE
注意事项
高通量DNA甲基化芯片的实验成功，取决于样本质量、操作标准化、数据分析严谨性的三重保障。通过优化亚硫酸氢盐转化条件、严格控制杂交参数，并结合生物信息学工具深入挖掘数据，可高效识别疾病相关甲基化标志物。
高通量DNA甲基化芯片的实验虽然简单，但每一个细节都可能影响实验结果的准确性。希望这篇文章能帮助你在实验中更加得心应手，探索DNA甲基化芯片！
如果您有任何疑问或建议，欢迎在评论区留言哦！我们下次再见！
最后，关注我，小编还会持续输出的。
长按二维码，了解更多
END
∨ 广州晟千生物科技有限公司 ∨
联系电话
18028503457
020-62680702