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多色免疫荧光TMA样本案例分析

多色免疫荧光TMA样本案例分析 TissueGnostics
2019-08-28
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导读:目标蛋白在肠上皮的表达及相关蛋白共定位分析。

       TMA容纳的信息量大,可以在短时间内高通量、快速、平行检测大批量组织样本中的多个实验指标,大大提高了实验效率。而且在一个TMA上进行多样本的比较,可以排除一系列复杂因素导致的组内或批间差异,使一次性多样本比较分析的准确性大为提高。


实验目的:目标蛋白在肠上皮的表达及相关蛋白共定位分析

实验流程:

  • 利用TissueFAXSSpectra多光谱全景组织扫描定量分析系统进行全景影像获取

  • 使用StrataQuest分析软件进行光谱通道拆分

  • 利用DAPI通道定位识别细胞核——对620通道细胞质染色阳性细胞进行识别及定量分析——对与620共标的通道进行定量分析


样本类型:7色免疫荧光TMA肠组织样本(180点)
扫描时间:4分19秒/点(D=2mm,20X)


分析流程:

在光谱图像获取阶段,TissueFAXS系统通过对组织区域进行预览,根据每个TMA点的轮廓建立ROI区域后,对每个ROI区域影像进行获取。在分析阶段,TissueFAXS拥有的TMA重排功能,可以针对每一个ROI区域进行重排,获得可以实时缩放的、包含所有TMA点的全景影像。此功能解决了由于样本制备操作不当,导致的TMA芯片纵横距离差异问题,以获得更美观、更便于观察对比的图像信息。

原始影像(DAPI, 520, 540, 570, 620, 650, 690)

ROI区域内的TMA点的细节图像,支持影像无损缩放。

通过缩放功能与图像选择功能,可以对原始图像及拆分后的单通道染色图像进行任意查看;利用通道自由组合/叠加功能,研究者可以独立分析目标Marker相互作用关系。对于每个原始通道和叠加后通道,可以单独调节高亮信号与背景的显示效果,以及改变伪彩颜色。

全景影像批量导出功能:可以一键批量导出光谱拍摄的原始影像。下图为图像导出后按光谱拍摄顺序进行叠加,赋予时间轴制作的光谱拍摄效果示意图。

光谱通道拆分后,独立的染色通道叠加后的多通道混合图像。颜色标注见右下角。

多通道叠加后的图像细节:可见不同染色标记蛋白位于肠上皮基底膜/上皮内/间质中。

图中所示绿色标记是根据细胞核的形态进行识别后得到的细胞核轮廓。

在组织原位,存在核形态不规则、核叠加、核黏连等现象,导致对细胞核内信号及细胞质内信号的定量分析产生误差。TissueFAXSCytometry可以根据细胞核大小与形态等参数,结合散点图的设门圈选,与原始图像的实时联动校验,排除对分析结果可能产生误差的数据。另外,具有热力图展示功能,在二维散点图的基础上,利用不同颜色标注了数据的聚集程度,为设置Cutoff及Gate提供更多的参考标准。

下图红色标记的是面积较大的非统计分析数据部分。

下图为DAPI通道细胞核识别区域,与620通道进行叠加。根据细胞质是否有620通道的Marker染色,以及染色的强弱/染色的形态,综合判断是否为细胞质染色阳性的细胞表型。通过指定细胞核周的判读半径及强度阈值,可以准确识别620通道阳性细胞。

下图中标记黄色,为符合染色强度与面积形态的620通道阳性细胞。二维散点图横坐标为染色面积,纵坐标为染色强度。

在筛选出620通道阳性细胞后,根据相同的原理,对620通道阳性细胞中的540通道阳性细胞进行准确识别与定量分析。下图为:从包含620阳性细胞数据的象限中,层层筛选,获得620-540共标的细胞阳性率结果540+620

570+620

650+620

       此外,TissueFAXSCytometry拥有的散点图-热力图-数据同屏叠加对比功能,可以整合多种数据分析的二维图像,便于研究者们直观的对比与校验;同时结合图像同屏对比功能,不但可以同屏预览,还可以支持多点实时联动缩放,便于观察/分析图像,打通信息分析时数据-图像之间的屏障。


【声明】内容源于网络
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TissueFAXS Cytometry 技术为用户提供了从影像到分析的全方位解决方案, 解决了图像数据,特别组织图像难以准确定量和可信度低的痛点。
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