上周，重庆国际免疫研究院在Frontiers in Immunology上发表文章，利用Beacon®单细胞光导平台进行快速针对Omicron变体的广谱中和抗体发现。吴玉章院士、赵婷婷教授和熊天晨博士为本文的通讯作者，余鹏、冉景平和杨蕊绮老师是本文的第一作者。
研究者利用Beacon®平台从有SARS-CoV-2 Omicron感染史的个体中分离出识别S蛋白受体结合域（RBD）的单克隆抗体，并确定了两个候选抗体2173-A6和3462-A4。这两个抗体均表现出强大的RBD结合能力，并表现对多种Omicron谱系假病毒的有效中和能力。Beacon®平台在10天时间内快速分离和鉴定来自人类的潜在中和抗体。这种高效的抗体发现路径将大大简化下游工作流程并加快创新治疗抗体的开发，不仅可以解决新出现的SARS-CoV-2变体，还可以对抗未来其他未知的传染病。
研究结果
RBD特异性记忆B细胞的分离
为了分离针对SARS-CoV-2变体的有效单克隆抗体，研究者从5名SARS-CoV-2 Omicron感染康复者和两名作为阴性对照的健康捐献者那里获取了血液样本。通过评估供体血清的抗原结合能力，发现供体3和供体7显示出与Omicron（BA.4/5）S蛋白以及RBD的反应性（图1A、B），且在体外中和实验里显示出对Omicron（BA.4/5）的中和功能（图1C）。
研究者从供体3和供体7以及一名健康供体的PBMC中富集B细胞，并采用分析流式细胞术评估每个供体的抗原特异性记忆B细胞的频率。供体3和供体7分别有2.21%和3.24%的记忆B细胞与RBD抗原反应（图1D）。对这些RBD特异性记忆B细胞进行分选以进行刺激，来自两个供体的细胞培养上清液中分泌的抗体表现出针对Omicron的RBD(BA.4/5)的反应性（图1E）。
图1. SARS-CoV-2样本供者表征
分泌RBD中和抗体的单个B细胞的鉴定
富集后的记忆B细胞经过8天激活成抗体分泌细胞，加载到Beacon®单细胞光导系统OptoSelect® 11k芯片上，持续新鲜灌注的培养基中含有促进浆细胞存活的添加物，使研究者能够对单个B细胞实现多轮的结合和功能筛选。作者首先测定数千个单B细胞分泌的IgG抗体是否有RBD结合活性。具体方法是：将生物素修饰的RBD（深灰色）与链霉亲和素偶联的聚苯乙烯珠（浅灰色）结合，然后加载到 NanoPens上方的通道中。单个B细胞将抗体（黑色Y形）分泌到各个NanoPens中，并用荧光anti-IgG二抗（红色）检测与RBD抗原结合的抗体。从NanoPen中扩散出来的反应性抗体被可视化为荧光“blooming”（图2A、B）。通过这种方法，研究者从NanoPens上4,246个单细胞中鉴定出137个RBD结合抗体。
图2A,B. RBD结合筛选示意图
在这些RBD阳性细胞的基础上，研究者增加一轮阻断筛选，以确定其是否能够产生阻断hACE2受体与RBD抗原的结合的抗体。将RBD结合的链霉亲和素微珠加载到NanoPens中，直接与RBD反应性抗体结合30分钟。随后，将可溶性hACE2加载到芯片中，使其与RBD结合。在一个荧光通道中检测到与RBD微珠结合的抗体，而在另一个荧光通道中检测到hACE2结合。我们发现3462号NanoPen中的单个B细胞分泌RBD结合抗体能够与hACE2竞争结合，珠子仅显示RBD结合的阳性信号（图2C、D）。相比之下，9058号NanoPen中的单个B细胞分泌的RBD结合抗体没有hACE2阻断特性，珠子显示出RBD和hACE2结合的阳性信号（图2C、D）。这项工作最终鉴定出四个单B细胞，它们产生阻断RBD-hACE2 相互作用的抗体。
图2C-E. hACE阻断筛选示意图和序列比对结果
这四个细胞从芯片上导出，并对每个B细胞的重链和轻链基因进行测序，然后将其克隆到免疫球蛋白表达载体中。研究者成功地三个候选细胞中获得了编码VH和VL的基因信息（图2E）。
图2E. 重链和轻链序列比对结果
RBD特异性抗体的结合活性验证
研究者表达纯化了单克隆抗体（mAb）958-A5、2173-A6和3462-A4。ELISA结合测定证明2173-A6和3462-A4与RBD（BA.4/5）抗原发生有效反应，EC50值为0.04ug/ml（图3A）。两种抗体也均能与多种SARS-CoV-2 Omicron谱系（包括XBB.1.16、XBB.1.5和EG.5.1）的RBD有效反应（图3A）。使用基于表面等离子共振 (SPR) 的光学测定法监测2173-A6和3462-A4与SARS-CoV-2 Omicron谱系RBD结合的实时结合和解离。两种抗体对每个Omicron谱系都表现出相似的RBD结合亲和力（图 3B）。2173-A6和3462-A4对Omicron BA.4/5、XBB.1.5和EG.5.1的RBD显示出快结合/慢解离动力学，然而，针对Omicron XBB.1.16的RBD表现出快结合/快解离动力学特征（图 3B）。总体而言，这些结果表明2173-A6和3462-A4与多个SARS-CoV-2 Omicron谱系的RBD发生强烈反应。
图3. SARS-CoV-2 RBD mAb反应性和亲和力表征
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2173-A6和3462-A4 mAb的中和特性测定
研究者通过基于假病毒的抑制测定评估2173-A6和3462-A4 mAb针对SARS-CoV-2变体的中和能力。结果表明，2173-A6和3462-A4均能有效中和广谱Omicron变体，包括BA.4/5、XBB.1.16、XBB.1.5和EG.5.1病毒 (图4A )。此外，这些抗体表现出中和Omicron B1.1.529谱系的能力，尽管与其他测试的Omicron变体相比效力有所降低（图4B、C)。然而，2173-A6和3462-A4均未能中和野生型SARS-CoV-2感染（图4B、C）。这表明Omicron谱系的S蛋白结构可能由于其RBD的突变而发生显着改变，使能够有效中和Omicron变体的mAb可能不再识别野生型SARS-CoV-2。研究者进一步通过竞争性ELISA确定2173-A6和3462-A4通过与相同或重叠的表位结合，有效中和SARS-CoV-2的多种Omicron变体（图4D）。
图4. mAb针对SARS-CoV-2假病毒的中和能力
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小结
基于Beacon®单细胞光导平台和OptoSelect纳米微流控芯片技术直接发现B细胞抗体的创新平台集成了光电定位(OEP)、微流控芯片和显微镜，可在纳米微流控芯片上进行单细胞操作、培养和表型分析。一项重大突破在于该平台能够直接识别芯片上的单个抗体分泌细胞（ASC），不仅突出了抗原特异性，还突出了其他属性，例如中和SARS-CoV-2受体结合域RBD等多轮筛选。高通量筛选后，感兴趣的ASC可以从微流控芯片中单独导出，用于回收编码原始抗体的天然VH和VL配对的序列。相比于杂交瘤、噬菌体展示和基于流式细胞仪分选的抗体发现手段具有更快速、减少人力投入、Assay选择丰富、提供多轮筛选等优势。
作者评价道：
“The Beacon instrument offers a platform that substantially reduces the labor-intensive workflow of the antibody discovery process primarily through its capacity for high-throughput screening and single-cell analysis. It will accelerate the development of novel therapeutic antibodies for treating newly emerging SARS-CoV-2 variants and other unknown infectious diseases in the future.”
参考文献：
Yu P, Ran J, Yang R, Zhu H, Lu S, Wu Y, Zhao T and Xiong T (2024) Rapid isolation of pan-neutralizing antibodies against Omicron variants from convalescent individuals infected with SARS-CoV-2. Front. Immunol. 15:1374913. doi: 10.3389/fimmu.2024.1374913
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