人多能干细胞（hPSC），包括人胚胎干细胞（ESC）和人诱导多能干细胞（iPSC）。hPSC集无限扩增、三胚层分化、易于基因工程改造潜能于一身，目前全球已开展近200项临床试验，PSC已逐渐成为干细胞治疗领域的重要临床研发方向。
hPSC的遗传和表观遗传稳定性是其应用于临床治疗和组织工程的关键因素。然而，hPSC在培养过程中容易受到各种因素的影响，如培养条件、细胞传代方法等。其中，酶促传代方式尤其与hPSC基因组不稳定性的增加有着密切关系[1][2]。
为了规避这一风险，科研人员已经研发出多种无酶解离方法。其中，基于EDTA的传代程序因其高效性和稳定性而备受青睐，并已成功应用于hPSC的衍生与扩增[3][4]。
下文将为大家深入剖析“如何使用EDTA实现hPSC的稳定传代”！！！
实验材料
ncTarget® hPSC Medium、Vitronectin、hPSC Dissociation buffer（EDTA传代工作液）、Blebbistatin、DPBS(不含钙镁)、6孔板。
*此操作教程以ncTarget®为例，操作程序同样适用于ncEpic® hPSC Medium（首宁生物，货号：RP01001）的无异种成分、成分明确的培养体系。
* hPSC常规培养时，当细胞汇合度超过50%，建议换液时可额外添加 50%的培养基；以6孔板为例，换液时每孔可添加3mL的培养基，以此类推。
传代时机
保持适当的克隆汇合度是体外培养hPSC细胞的另一个关键因素。一方面hPSC集落的频繁分离会导致细胞应激和细胞存活率降低；另一方面，过度生长的hPSC可能会出现染色体异常和自发分化。因此，为了维持高质量hPSC的培养，必须找到合适的细胞汇合度。
1.细胞汇合度达85%左右，移动视野观察细胞生长状态，整个皿密度均匀，没有过大的克隆或者克隆过于致密的部分，一般皿边缘比中心部分密度略大。
*一般情况下每 4 天传代一次，即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过 5 天。
2.细胞汇合度较低，但干细胞集落过大，中央细胞生长不良。
图1 iPSC汇合度图示
(A) 中小型 iPSC 克隆。(B 和 C) 中型和大型 iPSC 克隆。(D) 40% 汇合度的 iPSC 。(E) 60%-70% 汇合度的 iPSC 。(F) 85%-90%汇合度的 iPSC 。
传代比例
可根据细胞生长状态和实验需要按1:5~1:20的比例进行传代。
▪ 如果细胞正常，克隆团汇合度85%，大小均匀，建议按照1:15进行传代；
▪ 如果密度偏低，则可降低传代比例；密度偏高，则增加传代比例。
实验步骤
实验准备
1. 提前1h取出Vitronectin包被的6孔板置于生物安全柜恢复至室温或置于二氧化碳培养箱中恢复温度。
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2. 根据需传代的孔数加上传代后需接种的孔数准备2mL/孔的ncTarget完全培养基，并按1:4000比例加入Blebbistatin（10mM），恢复至室温。
*2mL的ncTarget完全培养基加入0.5μL的Blebbistatin（10mM）。
细胞传代
图2 细胞传代操作步骤
1. 从培养箱中取出待传代细胞，吸弃孔内ncTarget完全培养基，加入2mL/孔的DPBS(不含钙镁)，轻轻摇晃并吸弃。
2. 加入2mL/孔的EDTA传代工作液使溶液完全覆盖孔底，置于细胞培养箱中消化5-8min。
图3 EDTA消化hPSC图示
Tips
（1）消化5-8min后，显微镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化（图3C），若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间（图3A & B）。
（2）不同细胞消化时间有差异，建议以镜下观察细胞状态为依据。
（2）保持6孔板与培养箱金属隔板直接接触，使6孔板受热均匀，不要叠放。
3. 重悬细胞
3.1 消化结束后轻轻地从培养箱中取出消化的细胞，避免震荡摇晃细胞。显微镜下观察细胞变化，大部分细胞如图3C所示即可终止消化，倾斜吸弃EDTA传代工作液。
3.2 及时加入预温的含Blebbistatin的ncTarget完全培养基，2mL/孔，水平十字摇晃6孔板使细胞脱离基质，并轻柔吹打1-2次，使细胞团变小且均一。
Tips
（1）加入含Blebbistatin的ncTarget完全培养基时，可轻柔吹打细胞1-2次，不能超过2次，避免将细胞吹打成单细胞状态。
（2）避免刮擦细胞，有部分细胞（10%-15%）未脱离基质是正常现象，若有大量细胞未脱离则需延长消化时间。
（3）一次操作不要超过1个6孔板，当ncTarget完全培养基加入后要快速吸出。因为加入ncTarget完全培养基后，EDTA传代工作液的效果会很快被终止，细胞又会很快贴壁，而hPSC不能长时间处于EDTA传代工作液中（＜15min），所以收集接种细胞时操作必须快速。
4. 接种
4.1 吸弃预温的Vitronectin包被的6孔板中2孔的包被液，加入预温的含Blebbistatin的ncTarget完全培养基，2mL/孔。
4.2 在6孔板上标记细胞名称、代次（P#）、传代比例（#：#）、日期和操作人ID。
4.3 将步骤3.2获得的细胞悬液轻轻摇匀，按预先设定的传代比例均匀分配于孔板中。
Tips
也可将每板传代所需细胞量计算得出后，转移至15mL离心管中与预温的含Blebbistatin的ncTarget完全培养基悬浮定容到12mL，再均匀分配到吸弃包被液的6孔板中，以此类推。
5. 水平十字摇匀6孔板三次，置于37℃，5%CO2浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀6孔板三次，培养过夜。
6. 18-24小时后更换新ncTarget完全培养基，此后每天换液，4-5天后继续传代或冻存。
引用文献：
[1] Ibon G, Hadar A, Sesillo B F ,et al.Increased Risk of Genetic and Epigenetic Instability in Human Embryonic Stem Cells Associated with Specific Culture Conditions[J].Plos One, 2015, 10(2):0118307.DOI:10.1371/journal.pone.0118307.
[2] Bai Q, Ramirez J M, Becker F,et al.Temporal Analysis of Genome Alterations Induced by Single-Cell Passaging in Human Embryonic Stem Cells[J]. 2013
[3] Gong L, Chen B, Zhang J,et al.Human ESC-sEVs alleviate age-related bone loss by rejuvenating senescent bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J].[2024-11-15].
[4] Shan H, Ye J, Ping X H,et al.Establishment of an induced pluripotent stem cell line from a patient with hereditary transthyretin amyloidosis carrying transthyretin (TTR) mutation p.Phe53Val[J].Stem Cell Research, 2020,48:101940.DOl:10.1016/j.scr.2020.101940.
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