在科研和医疗领域，细胞系的稳定性对于实验的连续性和治疗的成功率至关重要。
通过不断优化和改进hPSC的培养过程，可以提高hPSC的生长效率和分化能力，保证hPSC的稳定性为后续的实验研究和临床应用提供更有力的支持。
下面我们就来详细介绍一下hPSC细胞培养的全过程（复苏、传代、冻存）。
实验材料
ncTarget® hPSC Medium、Vitronectin、hPSC Dissociation buffer（EDTA传代工作液）、Blebbistatin、hPSC高效冻存液、DMEM/F12培养基、DPBS(不含钙镁)、6孔板、移液管、离心管、冻存管、梯度程序降温盒等。
*此操作教程以ncTarget培养基为例，操作程序同样适用于ncEpic培养基;此操作教程以6孔板操作为例，操作程序同样适用于其他培养容器。
* hPSC常规培养时，当细胞汇合度超过50%，建议换液时可额外添加 50%的培养基；以6孔板为例，换液时每孔可添加3mL的培养基，以此类推。
hPSC复苏
实验准备
1. 将恒温水浴锅预热至37°C。
2. 提前1h取出用Vitronectin包被好的6孔板，置于生物安全柜或37℃培养箱中。
3. 取10mL DMEM/F12培养基 于离心管中，置于生物安全柜恢复至室温。
4. 4℃冰箱取出4mL ncTarget完全培养基，按照1:4000比例加入1μL的Blebbistatin（10mM），充分混匀后恢复至室温。
*1.将ncTarget® hPSC Medium的基础液和添加物混合配制成ncTarget完全培养基。
2.Blebbistatin需避光保存，使用锡纸包裹或褐色瓶储存。
5. 从液氮罐取出待复苏的细胞埋在干冰中，转移至细胞实验室。
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实验操作
1.从干冰泡沫箱中取出1支待复苏的细胞置于37℃水浴锅，手持轻轻摇晃，1min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时（剩余绿豆大小）取出。
2. 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜中；将细胞悬液移入15mL离心管中，逐滴加入10 mL DMEM/F12培养基，轻柔晃动混匀细胞。
3. 离心（160×g，5min），离心完成后可看到离心管底部有细胞沉淀。
图1 细胞沉淀图
4.将离心好的细胞置于生物安全柜中，吸弃上清，留存少量上清液（50uL左右），轻弹管底将细胞弹散；再加入4mL预温的含有Blebbistatin的ncTarget完全培养基重悬细胞沉淀，轻弹混匀细胞，尽量避免反复吹打，以免细胞团被吹散成单细胞。
*如有较大团块，可轻柔吹打1-2次，不要超过2次。
5. 吸弃预包被6孔板中2孔的Vitronectin包被液，将混匀的细胞按照2mL/孔接种到2孔中，水平十字摇匀三次。
6.显微镜下观察，50%细胞呈4-10个聚集的团块，密度为10%-20%。
图2 接种0h 40x的细胞形态
7.将培养皿置于培养箱中（37℃，5%CO2浓度，饱和湿度），再次水平十字摇匀三次，培养；18-24小时后，观察到细胞贴壁良好更换新的ncTarget完全培养基，之后每天更换培养基。
hPSC传代
实验准备
1. 提前1h取出Vitronectin包被的6孔板置于生物安全柜或置于二氧化碳培养箱中。
2. 根据需传代的孔数加上传代后需接种的孔数准备2mL/孔的ncTarget完全培养基，并按1:4000比例加入Blebbistatin（10mM），恢复至室温。
*2mL的ncTarget完全培养基加入0.5μL的Blebbistatin（10mM）。
①传代时机
1.细胞汇合度达85%左右，移动视野观察细胞生长状态，整个皿密度均匀，没有过大的克隆或者克隆过于致密的部分，一般皿边缘比中心部分密度略大。
*一般情况下每 4 天传代一次，即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过 5 天。
2.细胞汇合度较低，但干细胞集落过大，中央细胞生长不良。
②传代比例
可根据细胞生长状态和实验需要按1:5~1:20的比例进行传代。
▪ 如果细胞正常，克隆团汇合度85%，大小均匀，建议按照1:15进行传代；
▪ 如果密度偏低，则可降低传代比例；密度偏高，则增加传代比例。
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实验操作
1. 从培养箱中取出待传代细胞，吸弃孔内ncTarget完全培养基，加入2mL/孔的DPBS(不含钙镁)，轻轻摇晃并吸弃。
2. 加入2mL/孔的EDTA传代工作液使溶液完全覆盖孔底，置于细胞培养箱中消化5-8min。
图3 EDTA消化hPSC图示
（A）EDTA 消化4min；（B）EDTA 消化6min；（C）EDTA 消化8min。标尺：200μm。
Tips 1
（1）消化5-8min后，显微镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化（图3C），若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间（图3A & B）。
（2）不同细胞消化时间有差异，建议以镜下观察细胞状态为依据。
（2）保持6孔板与培养箱金属隔板直接接触，使6孔板受热均匀，不要叠放。
3. 重悬细胞
3.1 消化结束后轻轻地从培养箱中取出消化的细胞，避免震荡摇晃细胞。显微镜下观察细胞变化，大部分细胞如图3C所示即可终止消化，倾斜吸弃EDTA传代工作液。
3.2 及时加入预温的含Blebbistatin的ncTarget完全培养基，2mL/孔，水平十字摇晃6孔板使细胞脱离基质，并轻柔吹打1-2次，使细胞团变小且均一。
Tips 2
（1）加入含Blebbistatin的ncTarget完全培养基时，可轻柔吹打细胞1-2次，不能超过2次，避免将细胞吹打成单细胞状态。
（2）避免刮擦细胞，有部分细胞（10%-15%）未脱离基质是正常现象，若有大量细胞未脱离则需延长消化时间。
（3）一次操作不要超过1个6孔板，当ncTarget完全培养基加入后要快速吸出。因为加入ncTarget完全培养基后，EDTA传代工作液的效果会很快被终止，细胞又会很快贴壁，而hPSC不能长时间处于EDTA传代工作液中（＜15min），所以收集接种细胞时操作必须快速。
4. 接种
4.1 吸弃预温的Vitronectin包被的6孔板中2孔的包被液，加入预温的含Blebbistatin的ncTarget完全培养基，2mL/孔。
4.2 在6孔板上标记细胞名称、代次（P#）、传代比例（#：#）、日期和操作人ID。
4.3 将步骤3.2获得的细胞悬液轻轻摇匀，按预先设定的传代比例均匀分配于孔板中，水平十字摇匀三次。
Tips 3
也可将每板传代所需细胞量计算得出后，转移至15mL离心管中与预温的含Blebbistatin的ncTarget完全培养基悬浮定容到12mL，再均匀分配到吸弃包被液的6孔板中，以此类推。
5.置于培养箱中（37℃，5%CO2浓度，饱和湿度），水平十字摇匀三次，培养过夜；18-24小时后更换新ncTarget完全培养基，此后每天换液，4-5天后继续传代或冻存。
hPSC冻存
实验准备
1.准备相应数量的1.5/2mL冻存管，标记细胞名称、代次（P#）、日期、操作人ID。
2.提前将梯度程序降温盒置于4℃冰箱中预冷。
①冻存时机
显微镜下观察细胞状态良好，细胞汇合度达85%左右可以收获冻存，一般6孔板可收集2-4×106个活细胞/孔，每孔可冻存1管。
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实验操作
1. 从培养箱中取出待冻存细胞，吸弃孔内ncTarget完全培养基。加入2mL/孔的DPBS(不含钙镁)，轻轻摇晃后吸弃。
2. 加入2mL/孔的EDTA传代工作液使溶液完全覆盖孔底，置于37℃培养箱中消化5-8min。
图4 EDTA消化hPSC图示
（A）EDTA 消化4min；（B）EDTA 消化6min；（C）EDTA 消化8min。标尺：200μm。
3. 重悬细胞
3.1 消化结束后轻轻地从培养箱中取出消化的细胞，避免震荡摇晃细胞。显微镜下观察细胞变化，大部分细胞如图4C所示即可终止消化。倾斜吸弃EDTA传代工作液。
3.2 摇匀hPSC高效冻存液，每孔加入1mL冻存液，轻柔吹打。
Tips 4
hPSC高效冻存液中的DMSO易沉积在溶液下部，使用前务必要摇匀，如未摇匀可能造成开始用时DMSO浓度不够，后面用的DMSO浓度过高，造成冻存细胞的不稳定。
4. 吸取细胞悬液加入1.5/2mL冻存管中，将冻存细胞置于梯度程序降温盒中。
5. 置入-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮罐中长期保存；或使用程控降温设备将细胞降至-80℃以下后直接转入液氮储存。
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