在科研和医疗领域，细胞系的稳定性对于实验的连续性和治疗的成功率至关重要。为了避免污染、设备故障或操作失误导致的细胞丢失，我们采取了冻存策略，为细胞提供了一层额外的安全网。
当需要用冻存的细胞进行研究时，可将之解冻并进行复苏接种。而解冻过程会直接影响细胞的复苏效率和活率，采用良好的技术快速完成操作可确保细胞能在解冻后成功复苏。下面我们就来介绍一下hPSC细胞解冻的最佳方法。
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实验材料
Shownin® ncTarget®（hiPSC/hESC培养基）*，Matrigel ，Shownin® Blebbistatin（ROCK 通道抑制剂），DMEM/F12培养基，6孔板，10mL移液管，15mL离心管。
*此操作教程以ncTarget®+Matrigel培养体系为例，操作程序同样适用于Shownin® ncEpic®+Shownin® Vitronectin培养体系。
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实验步骤
实验准备
1. 将水浴锅预热至37°C。
2. 将Matrigel包被的6孔板，提前置于37℃培养箱恢复30分钟以上。
3. 取4mL ncTarget完全培养基，按照1:4000比例加入1μL的Shownin Blebbistatin（10mM），恢复至室温。
4. 取10mL DMEM/F12培养基于15ml离心管中，恢复至室温。
5. 从液氮罐取出待复苏细胞，转移置于干冰泡沫箱中，将干冰泡沫箱转移至细胞实验室中。
细胞复苏
图1：实验步骤图示
取出1支冷冻的细胞置于37℃水浴锅手持轻轻摇晃，1min-2min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时（剩余绿豆大小）取出。
2. 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜；将细胞悬液移到事先准备好的15mL离心管中。
3. 逐滴加入10 mL DMEM/F12，轻柔晃动混匀细胞。
4. 160×g离心5min。
5. 离心完成后可看到离心管底部有细胞沉淀，将离心好的细胞置于生物安全柜中，吸弃上清，留存少量上清液（50ul左右），轻弹管底将细胞弹散，再加入预温的4mL的Blebbistatin+ncTarget完全培养基混匀细胞，轻弹混匀，尽量避免吹打，如有较大团块，可轻柔吹打1-2次，不要超过2次。
6. 吸弃6孔板中2孔的Matrigel包被液，将混匀的细胞按照2mL/孔接种到2孔中。水平十字摇匀三次，镜下观察，置于37℃，5%C02浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次，培养。18-24小时后换新的ncTarget完全培养基，之后每天更换培养基。
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注意事项
1. 培养基一定要恢复至室温。
2. 细胞解冻时应在冰晶未完全消失时及时取出，不能等到细胞完全融化。
3. 离心完的细胞沉淀重悬时不可反复吹打。
4. 上述细胞复苏步骤6镜下观察，如下图所示要求细胞分布均匀，团块大小均一， 50%细胞呈4-10个聚集的团块，密度为10%-20%。
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