传代操作后，如留下少量纯度高、稳定性好的细胞时，可迅速将细胞冻存作为种子库使用。而稳定的种子来源，还需要冻存液的保障。
在冷冻过程中，冻存液可以保护细胞免受冰晶、细胞内外渗透压失衡等问题造成的损伤；同时，冻存液不仅提供了必要的营养成分，也可帮助细胞维持正常的生理功能，在复苏时更容易恢复活性。
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接下来，我们一起深入了解一下，如何使用hMSC高效冻存液，高效冻存人间充质干细胞（hMSC）。
实验材料
hMSC高效冻存液、ncMission® hMSC Medium V3.0(首宁生物，货号RP02010)、hMSC温和消化液（首宁生物，货号：SN-02-0040）或 0.5×TrypLE、10mL移液管、离心管、冻存管、梯度程序降温盒。
实验步骤
实验准备
1. 根据所需冻存的细胞量，标记相应数量的冻存管（参考数量：1-5×106 cells/mL/管）。
2.将ncMission® Basal Medium V3.0和ncMission® Supplement V3.0混合配制成ncMission® V3.0 完全培养基。
3. 提前将ncMission® V3.0 完全培养基、hMSC温和消化液、DPBS或生理盐水预温至37℃。
4. 提前将梯度程序降温盒置于4℃冰箱中预冷。
冻存时机
显微镜下观察细胞状态良好，细胞汇合度达90%左右，可进行消化冻存。
冻存hMSC
01
吸弃培养基，使用DPBS（不含钙镁）清洗1遍、吸弃。
02
加入 hMSC温和消化液（首宁生物，货号：SN-02-0040）或 0.5×TrypLE 后，置于细胞培养箱消化5-8分钟，随后加入ncMission® V3.0 完全培养基 / DPBS 进行稀释。
03
将细胞悬液转移至离心管中，离心（250×g，5min，水平转子）。
04
弃上清，加入ncMission® V3.0 完全培养基重悬细胞，随后取样计数。
05
离心（250×g，5min，水平转子）。
06
弃上清，根据细胞计数结果，逐滴加入适量hMSC高效冻存液重悬细胞，随后将离心管中的细胞混合液分装于已标记完全的冻存管中（根据细胞数确定冻存管数）。
07
梯度程序降温：
将含有细胞悬液的冻存管置于4℃预冷的程序降温盒中（e.g.Nalgene Mr.Frosty，5100-0001），再将程序降温盒置于-80℃冰箱中，24h后转入液氮罐长期保存（温度不高于-135℃）。
或者使用程序降温仪（e.g.Thermo CryoMed）对冻存管中的细胞悬液按照-1℃/min降温至-80℃以下后（参考仪器操作说明），立即转入液氮罐中长期保存（温度不高于-135℃）。
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