基于指导原则的要求，天勤生物开展了中药、化药、生物制品等不同药物类别的儿科用药非临床安全性研究，成功助力多个新药品种获得临床默示许可，积累了丰富的幼龄动物非临床试验经验，在幼龄大鼠、小鼠 、比格犬、食蟹猴等常见动物种属中开展了多项安全药理学、一般毒理试验伴随毒代动力学、局部刺激和免疫原性等试验，拥有大量历史背景数据。
上期文章介绍了幼龄动物试验中交叉抚育操作程序及关注点（点击此处查看原文），本期内容将结合本机构试验经验，分享“幼龄大鼠的分组方案”。
通常，一般毒性研究中成年动物谱系的来源情况未知，但幼龄动物毒性研究中每只幼仔的谱系来源大概率是可以获得的，通过繁殖得到的窝，幼仔之间是自然的同窝兄妹。与非同窝兄妹相比，兄弟姐妹更倾向于同类反应，即相同窝的后代对于一个受试物的反应比非同窝更类似，称为窝效应(effect of litter)。幼龄动物毒性研究中，同一剂量组应避免放入过多来自同一窝的幼仔，也就是说，需要足够数量的窝以避免这种窝效应。
幼龄动物非临床研究中窝的构成(窝内仔鼠的分配方法)有以下几种：①窝内设计(within litter design)；②窝间设计(between litter design )；③每窝1只幼仔/性别(one pup per sex per litter design)；④交叉抚育设计(fostering design)。每种窝的构成方法都有其优点和缺点(不易于统筹、交叉污染的可能性和统计难度)。这些分配的原则是基于将“窝”作为实验测试和分析的单位，而不存在由评价部门来评价孰好孰坏。分配方法的选择应该基于对受试物的了解、潜在污染的风险、现有毒性数据及动力学等方面的数据。显然，“窝”分配方式的选择对于大鼠离乳前给药是最关键的。如果离乳后给药，则同窝仔鼠分散至各个剂量组。为简单起见，本文中窝的大小和性别比例为8只幼仔(4雄和4雌)，研究设计为4个剂量组（1个对照组及低、中和高3个剂量组)，每组12只/性别。
01
图中是基于每个窝内都包含所有剂量组的理想情况（图1），每窝1只幼仔/性别随机分配给每个剂量组，每窝幼仔的构成为：对照组的1# 雄仔和1# 雌仔低剂量组的1# 雄仔和1# 雌仔，中剂量组的1# 雄仔和1# 雌仔及高剂量组的1# 雄仔和1# 雌仔。这个设计中，两个同性别的同窝胎仔不会被分在同一剂量组，如果每组仅获得相同数量的单性别幼仔，就需要更多的窝。
图1 “窝内设计或裂窝设计”的每窝
胎仔的构成举例
根据特定的实验设计剂量组数或者窝大小，一个真正的窝内设计有时候可能很难实现。某些情况下可能会做适当的修改，这就涉及裂窝设计。裂窝设计是窝内设计的一种变换，用于给药组数量超过每窝幼仔的数量时。例如，如果研究设计需要7组，而每窝都需要有所有给药组，那么单窝的尺寸就太大了。但这种设计又会增加更多的不确定性和统计困难。
02
与窝内设计相比，该设计非常简单。窝内所有幼仔接受相同剂量。每窝幼仔的构成包括（图2，以对照组为例）低剂量组的1# 雄仔和1# 雌仔、低剂量组的2# 雄仔和2# 雌仔、低剂量组的3# 雄仔和3# 雌仔及低剂量组的4# 雄仔和4# 雌仔：其他剂量组以此类推。
优势
该模型简化了给药程序，最小化了技术人员的工作量。亲代的预期遗传因素和母鼠的照料因素等都同等给予子代。允许兄弟姐妹被分配到各自独立的观察终点，因此在管理上更加容易。不同剂量水平的动物给药交叉污染的概率最低，尤其是涉及收集毒代动力学样本。
缺点
由于众所周知的窝效应，它不是最优统计。母鼠对幼仔的照料及组间潜在的遗传偏差可能是混杂因素。该设计需要的窝数量最多，取决于是否进行窝的标准化(如PND4进行均窝，每窝原则上保留4雌4雄)，给药的幼仔数量很容易每天超过1 000只，甚至1 200只以上，这使得研究成本更高，因此为实验设计提出了统筹运作方面的挑战。当考虑到多个分析终点时，对于大部分实验室来说，在正确执行研究过程方面需要考虑的因素太多。此外，这种特殊情况下的设计，“窝”（而不是单个“幼仔”）作为一个评估单位。因此，当窝效应的因素被忽视时，窝间设计就会产生疑问。统计分析时每窝的兄妹仔鼠作为一个独立的单位被分配到同一剂量组，对于所观察到的反应，窝间设计如果使用不当，会增加而不是降低窝效应。
图2 “窝间设计或整窝设计”的每窝
胎仔的构成举例
应用
基于上述考虑，窝间设计应该仅用于以下情况：①随着年龄增加，研究者需要不断剔除动物；②在一个特殊的终点，整窝数据均需要检查同窝仔鼠来源的数据是用于观察窝的平均值；③同窝仔鼠用于不同终点的选择。
几乎没有一项研究设计，会同时使用窝内设计和窝间设计去评价同一个终点。但是有一项类似的研究，PND14-20幼仔给予9 mg/kg三乙基锡，窝内设计的幼仔体重低于窝间设计；三乙基锡给药后，窝内设计比窝间设计的幼龄动物更活跃。相反，另一项研究中，改良的窝内设计(一半动物)与窝间设计（所有动物）相比，6-羟基多巴胺诱导的活动性更弱。此外，在6-羟基多巴胺诱导的活动性实验中，窝内设计中的幼仔比窝间设计逃避得更好。尽管这些结果不能决定性地说明窝内设计相对更科学，但也确实表明实验组别的不同设计可以得到不同的结果。当然，并没有监管部门指导原则明确指出应该使用何种设计。
03
如果每个剂量组由12窝幼仔组成，每窝雌雄各1只幼仔，也就是每个剂量组由雌雄各12只幼仔共24只组成(图3)。
优势
这种设计消除了窝效应，因此统计上是可接受的；也不会有污染问题并简化了技术人员的工作量。
图3 “每窝1只幼仔/性别设计”的
窝胎仔的构成举例
缺点
窝数量需求增加（4个剂量组，每组12只幼仔/性别，则需要48窝），以及多数幼仔被丢弃（48窝，每窝丢弃6只，共288幼仔），这样的话，“每窝1只幼仔/性别” 的设计很难向实验动物伦理委员会解释。
应用
如果从围产期研究中选择子代亚群进行持续评估时，使用“每窝1只幼仔/性别”的设计是可行的。围产期研究每组通常20~25窝，有足够数量的动物允许离乳后“每窝1只/性别”来延续围产期研究，离乳后采用剩余窝中“每窝1只幼仔/性别进行幼龄毒性研究。如果幼仔来自母鼠给予受试物的窝中，幼仔通过乳汁暴露的程度不清楚，为了消除离乳前接触受试物的影响，可以从对照组的窝中选择幼仔，然后分配至给药组（通常每窝8只幼仔，足够分配至低、中和高3个剂量组）。如果离乳时或离乳后开始给药，这是唯一可行的设计；该设计还需要假设实验室有足够的资源对同一受试物同时进行围产期研究和幼龄毒性试验，并且两项研究中与年龄有关的行为学检测最好也在同一时间进行。
04
为了努力减小窝效应和遗传偏差等影响，一些研究中使用交叉抚育设计。此设计为幼仔出生后立刻由新的母鼠抚养，每窝胎仔都是由来自其他窝的幼仔组成，新的抚育窝内不使用任何同性兄弟姐妹，所有幼仔接受同样的给药处理，在理论上最小化了窝效应和遗传倾向。
1
优势
幼仔给药之前进行交叉抚育，遗传因素（同窝仔鼠）和母鼠的影响随机化到整个窝，也就随机分布在所有给药组内。该设计消除了窝效应，因此统计上是可接受的；由于每窝所有的幼仔接收相同的剂量，消除了交叉污染的风险并简化日常技术人员的工作量。
2
缺点
表面上看起来这种方法可能比较简单，但是对于所观察到的反应，它可能变得难以跟踪，以及无法评估遗传学或妊娠对受试物的影响。而且，交叉抚育的过程是一个耗时和劳动密集型的过程。它不是用一只雌鼠的窝取代另一只雌鼠的窝，而是一只雌鼠的原始窝被其他雌性的几窝幼仔分别替换。抚育设计需要足够数量且在同一天出生的窝。如果某一天满足交叉抚育设计的窝数量不足，那么这天即无法进行交叉抚育。因此，仔细的统筹规划是确保“窝”高效利用的关键。交叉抚育设计的使用是在幼仔身份可以辨认的前提下进行的。
此外，如果一只母鼠排斥交叉抚育的窝（如果是出生后几天内形成新窝的话，这种情况很罕见），这个组的很大一部分就会被连累。
最后，抚育设计也不能完全消除“窝效应”。相反“抚育窝”母鼠所提供的照料变得与亲生母鼠提供的窝效应一样重要。因此，虽然遗传因素可以均匀分布，但使用交叉抚育的方法并不完全缓解使用窝间设计的问题。在使用大鼠交叉抚育设计的几项研究中，观察到环境窝效应也会对抚育设计的“窝”产生影响，如“抚育窝”中的体重增加速度类似。如果采用了窝内设计，交叉抚育即不可取，因为它增加了研究的复杂性，在控制偏差上改进很少。此外，由于统筹的原因，当需要大量的窝数时也不推荐使用交叉抚育方法进行研究，虽然，已有成功的例子，通过添加单个或几只幼仔到一些窝可以实现所需窝的大小。
（本文节选自孙祖越教授、周莉教授主编出版的《儿科用药非临床安全研究》一书）
周莉
医学博士，研究员
天勤生物执行副总裁
主编出版专著《食蟹猴生殖与发育毒理学》、《儿科用药非临床安全性研究》、《常见实验兔和大鼠畸形图谱》、《药物生殖与发育毒理学》、《药物生殖与发育毒理学发展史》和《前列腺毒理学》等7部。
关于天勤生物
天勤生物成立于2009年，是一家以大动物试验为特色、聚焦新药研究与评价的CRO高新技术企业，为客户提供一站式创新药物研发服务，致力于以更短的实验周期、更高质量的研究报告加快新药上市进程。
▪ 强大的项目承接能力：已有近30000㎡符合GLP规范的实验室投入使用，在建实验场地约80000㎡，可开展基于猴、犬、兔、大鼠、小鼠、豚鼠等实验动物的试验研究；
▪ 国际接轨的体系：GLP实验室满足国内、美国FDA、欧盟OECD、澳洲TGA等GLP标准，并通过国际AAALAC完全认证；
▪ 丰富的项目经验：国内外知名专家团队领衔，千余项专题研究、300多个新药申报品种、近百个中外申报的品种通过中国CFDA/NMPA 、美国FDA和澳大利亚TGA的审批进入临床或上市。
19807273015（肖经理）
关于天勤生物武汉分公司
湖北天勤生物武汉分公司（安全性评价中心）是湖北省第一家民营GLP研究机构，现有一支近300人的专业技术团队，具备了开展中国NMPA、美国FDA项目的质量管理体系和资质，同时通过了国际AAALAC完全认证。公司目前拥有超过10000m2的设施，可开展啮齿类和非啮齿类的单次给药、重复给药、生殖【大鼠I、II和III段；小鼠I、II和III段；兔II和兔III段；伴随食蟹猴（性成熟）重复给药毒性试验的生育力评价研究、食蟹猴伴随胎盘屏障和血乳屏障的EFD试验和增强的围产期发育（ePPND）毒性试验】、遗传毒性（Ames、微核和染色体畸变）、免疫原性、安全药理、局部刺激、毒代动力学和致癌等9项GLP试验以及药效、药代动力学、毒性探索性试验（DRF）等，尤其在生物制品、化药和中药和儿科用药等方面拥有大量的非临床评价经验和成功案例，同时在上述药物的生殖与发育毒性试验设计、结果判定等方面积累了宝贵的经验；建立了国内领先的食蟹猴生殖毒性与发育毒性研究平台，是国家科技部重大新药创制科技重大专项的药物安全性评价示范平台之一。
13585702671 (周女士)
15927305616 (田先生)
