多重PCR靶向检测与引物设计- 大数跨境

康昱盛

2024-04-02

导读：最近我们收到许多PrimerPlex的产品咨询。今天我们给大家介绍多重PCR靶向检测及PrimerPlex软件的优势。

最近我们收到许多PrimerPlex的产品咨询。伙伴们的需求都是想通过PrimerPlex进行多重PCR/qPCR引物探针设计，或用于病原体鉴定、高通量SNP基因分型、突变分析、基因缺失分析、模板定量、连锁分析等。今天我们给大家介绍多重PCR靶向检测及PrimerPlex软件的优势。

多重PCR靶向检测方法

多重PCR是一种广泛使用的分子生物学技术，用于在单次PCR实验中扩增多个靶标。在多重检测中，可以通过在反应混合物中使用多个引物对来扩增多个靶序列。作为PCR实际应用的延伸，该技术有可能在实验室内节省大量时间和精力，而不会影响实验的实用性。

多重PCR方法的示意图，图片引用：S.Rosel,2021

多重PCR的优点

1.内部对照

简单PCR中的潜在问题包括由于反应失败而导致的假阴性或由于污染而导致的假阳性。多重检测中经常会出现假阴性，因为每个扩增子都为其他扩增片段提供了内部对照。

2.效率

多重PCR的试剂费用和制备时间比使用多管单重PCR的系统要少。多重反应是保存供应短缺的昂贵聚合酶和模板的理想选择。

3.模板质量指示

在多重反应中比在简单的PCR反应中可以更有效地确定模板的质量。

4.模板量指示

多重PCR的指数扩增和内标可用于评估样品中特定模板的量。要通过多重PCR对模板进行准确定量，必须考虑参考模板的数量、反应循环的次数以及每个循环对理论倍增产物的最小抑制作用。

多重PCR的类型

多重反应可大致分为两类：

1.单模板PCR反应

该技术使用单个模板（可以是基因组DNA）以及几对正向和反向引物来扩增模板内的特定区域。

2.多模板PCR反应

在同一反应管中使用多个模板和多个引物组。多个引物的存在可能导致彼此交叉杂交以及与其他模板错误引发的可能性。

多重PCR的引物设计参数

特异性引物组的设计对于成功的多重反应至关重要。

1.引物长度

多重PCR检测需要设计大量的引物，因此要求设计的引物具有合适的长度。通常，使用长度在18-22个碱基范围内的短引物。

2.温度

使用Tm相近的引物，优选在55°C-60°C之间。对于GC含量高的序列，建议使用Tm较高（优选75°C-80°C）的引物。对于同一反应中使用的引物来说，Tm最好控制在3°-5°C之间。

3.特异性

在准备多重检测时，考虑所设计引物对目标序列的特异性非常重要，尤其是当多个目标序列在一个反应中时存在竞争。

4.避免引物二聚体形成

应检查设计的引物是否形成引物二聚体，所有引物均存在于反应混合物中。二聚化导致非特异性扩增。其他参数类似于标准PCR引物设计。

然而，知道了引物设计参数是一回事，怎么设计，又是另外一个故事了，我们的伙伴们在设计过程中，常常出现伪影，脱靶，无目标扩增的情况。

漫长的引物设计、验证过程不仅浪费了伙伴们实验的成本和时间，更增加了伙伴们的焦虑。不慌，多重PCR引物设计的救星来了~~🌟🌟🌟

PrimerPlex是设计用于多重PCR检测的特定寡核苷酸的高效工具

PrimerPlex使用专有算法，在均匀的反应条件下为100多个序列设计最佳的多重引物组。在对引物池中的所有引物进行筛选并尽量减少Tm错配后确定引物集（primer sets），以确保特异性扩增和高信号强度。在此过程中，它会在几秒钟内分析数百万个可能的多重引物组，并提供备选组列表。您可以指定一组设计引物对之间的最小产物长度差异，以便更好地可视化凝胶上的条带。为确保引物特异性，可以从PrimerPlex中根据NCBI提供的任何基因组数据库对引物进行BLAST搜索。

对于SNP基因分型研究，PrimerPlex设计了SNP侧翼引物。结果包括每个DNA模板的引物对，具有产物大小、退火温度和其他物理化学寡核苷酸特性。二级结构的图形显示也可用于帮助确定它们是否会阻碍反应。

多重PCR检测用于基因表达分析（使用凝胶电泳进行终点检测）、基因分型等高通量SNP应用、下一代测序所需的靶标富集、病原体检测、菌株分型和单倍分型。PrimerPlex还设计了最佳的等位基因特异性捕获探针和等位基因特异性引物扩展（ASPE）引物，用于高通量SNP基因分型检测。