RT-PCR反应操作程序和标准适用于进行SYBR Green qPCR反应的研究人员。
1 试剂和材料
带有ROX的PlatinumR SYBRRGreen qPCR SuperMix-UDG(invitrogen货号 C11744-100 和C11744-500)
cDNA模板
PCR 引物
去离子水
Drummond微型移液器;
低蒸发U-形底96-孔板（Corning-Costar）
低蒸发平底96-孔板（Corning-Costar）
一次性消毒的移液tip头（Corning-Costar）
超净工作台
一次性消毒的1.5ml EP管。
一次性消毒无菌移液枪头。
冰盒。
2 操作程序
2.1 融解2×SYBRR Green qPCR SuperMix后，放置冰上待用。
2.2混合qPCR反应组分
冰上进行qPCR反应液的配制（3-6个复孔）
反应时，在96-孔板或PCR管中加入浓度为2*的带有ROX的PlatinumRSYBRR Green qPCR SuperMix-UDG、引物、cDNA模板，去离子水补足20或25ul反应体系。
试剂 |
终浓度 |
|
2×SYBRR Green qPCR SuperMix |
10μL |
1× |
qPCR上游引物（10μM） |
0.5μL |
0.5μM |
qPCR下游引物（10μM） |
0.5μL |
0.5μM |
cDNA模板 |
0.5μL |
|
ddH2O |
8.5μL |
|
Final Volume |
20μL |
2×SYBRR Green qPCR SuperMix设定为总反应体积的一半，其它组分请按最适比例进行调整。如需变更总反应体积，请保持最适条件下各组分的比例。
引物终浓度可在0.2μM～0.4μM范围内调整，一般条件下0.2μM的量即可达到理想的效果。
充分混匀qPCR反应液，添加至PCR反应管中，短暂离心，确保所有试剂到反应管底部。
2.3荧光定量PCR反应。
96-孔板或PCR管放入荧光定量PCR仪，设定变性时间、退火时间、延伸时间。设定熔解曲线。开始RT-PCR反应。
qPCR 反应，使用标准的三步法进行检测
循环数 |
步骤 |
时间 |
|
1 |
预变性 |
95℃ |
10min |
变性 |
95℃ |
10sec |
|
40 |
退火 |
57℃ |
20sec |
延伸 |
72℃ |
10sec |
或者用两步法。
循环数 |
步骤 |
温度 |
时间 |
1 |
预变性 |
95℃ |
10min |
变性 |
95℃ |
10sec |
|
40 |
退火+延伸 |
68℃ |
20sec |
退火+延伸温度可调整。通过做温度梯度调整。
对于用SYBR Green 染料法进行的qPCR的检测的反应都需要在循环结束后立即进行融解曲线分析
检测温度 |
恒温时间 |
95℃ |
15sec |
55℃ |
15sec |
95℃ |
15sec |
3 结果分析
3.1 绝对定量
从将未知样品和标准品一起扩增获得标准曲线和线性方程，
把未知样品的CT带入线性方程，可以进行数据得到未知样品浓度。
3.2 相对定量2-DDCt法
2-DDCt=2-[(Ct目的基因-Ct内参基因)]处理组-[(Ct目的基因-Ct内参基因)]对照组
4 注意事项
4.1 如果无模板对照中有信号存在或熔解曲线中有多个峰，则可能模板或试剂被核酸污染。
4.2 模板浓度是决定Ct大小的最主要因素
4.3 引物可用普通PCR所用各种软件如primer primer 5，oligo6等设计。引物设计应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
①引物长度一般为18~30碱基
②引物序列中G+C含量一般为40%~60%
③退火温度在55℃～75℃
④避免扩增模板的二级结构区域
⑤3’端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
⑥ 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
⑦PCR产度为75—300bp最佳。
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