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成功完成Western Blot检测，必须满足4个条件：
凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析
吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析
处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上
处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测
成功进行WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：
阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率
阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性
二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性
内参对照：检测标本的质量和二抗系统
空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果
WB检测基本过程
1、获取细胞或组织裂解物
1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer：
蛋白位置 |
推荐buffer |
全细胞 |
NP-40 or RIPA |
胞浆（可溶性蛋白） |
Tris-HCl |
胞浆（骨架结合蛋白） |
Tris-Triton |
膜蛋白 |
NP-40 or RIPA |
核蛋白 |
RIPA or 核蛋白提取试剂盒 |
线粒体蛋白 |
RIPA or 线粒体分离试剂盒 |
亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量
2)选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！
2、蛋白定量
常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCAassay。定量后，可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白
3、电泳分离蛋白质
根据待测蛋白状态确定电泳条件：
| 待测蛋白状态 | 凝胶条件 | 上样buffer | 电泳buffer |
| Reduced - Denatured | 还原，变性 | 含β-巯基乙醇或DTT，含SDS | 含SDS |
| Reduced -Native |
还原，不变性 | 含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS | 不含SDS |
| Oxidized - Denatured | 不还原，变性 | 不含β-巯基乙醇或DTT，含SDS | 含SDS |
| Oxidized - Native | 不还原，不变性 | 不含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS | 不含SDS |
根据待测蛋白分子量大小确定凝胶浓度
蛋白分子量（kDa） |
凝胶浓度（％） |
4-40 |
20 |
12-45 |
15 |
10-70 |
12.5 |
15-100 |
10 |
25-200 |
8 |
4、转膜
根据不同的检测目的和待测蛋白的特性，选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有：PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。各种膜的技术参数及比较如下：
| PVDF膜 | NC膜 | 尼龙膜 | |
| 灵敏度和分辨率 | 高 | 高 | 高 |
| 背景 | 低 | 低 | 较高 |
| 蛋白结合能力 | 100-200ug/cm2（适用于SDS存在时与蛋白结合） | 80-100ug/cm2 | >400ug/cm2 |
| 机械强度 | 强 | 干的膜易脆 | 软而结实 |
| 溶剂抗性 | 强 | 差 | 差 |
| 使用前是否需要浸润 | 100%甲醛润湿 | 缓冲液润湿 | 缓冲液润湿 |
| 适用染色方法 | 胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰 | 胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁 | 不能用阴离子染料 |
| 适用检测方法 | 显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测 | 显色法、化学发光、荧光、放射性 | 显色、化学发光、放射性 |
| 适用范围 | 普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测 | 普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白 | 低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用 |
| 价格 | 高 | 较低 | 低 |
5、封闭
去掉膜上多余的非特异性结合位点，降低背景。常用的封闭溶液有：含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS
6、一抗孵育
一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键：选择一抗有以下几个注意点：
选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证）
选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证）
选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体
一抗的保存和使用：
根据说明书的要求条件进行抗体的保存；一般需要将抗体分装后放入-20度保存，绝对避免反复冻融。
抗体的工作液最好现配现用，在4度保存最好不要超过2周
根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。由于实验室条件和检测方法等的差异，说明书推荐的稀释比例只作参考，需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测，然后选择信噪比最好的抗体浓度进行实验。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:100-1:3000）。
孵育条件：推荐4°C孵育过夜（一般大于18个小时），根据抗体亲和力不同孵育时间有所区别
内参的选择和使用：WB过程监测以及目的蛋白定量的标准！
WB常用内参及其技术参数：
| 内参名称 | 分子量大小 | 适用范围 |
| beta-actin | 43kDa | 胞浆和全细胞 |
| GAPDH | 30-40kDa | 胞浆和全细胞 |
| Tubulin | 55kDa | 胞浆和全细胞 |
| VCDA1/Porin | 31kDa | 线粒体 |
| COXIV | 16kDa | 线粒体 |
| TBP | 38kDa | 细胞核 |
7、二抗孵育
根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:1000-1:20000）。孵育条件一般为室温1-2小时
8、底物孵育
选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光，灵敏度高且背景低，节省抗体用量
9、结果分析和检测
凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片
Note：从封闭开始，每步之间都需要用TBST进行洗涤，3次，每次5min
WB常见问题及技术要点：
WB过程中常见的问题及可能原因分析
问题 |
可能原因 |
验证或解决办法 |
| 转膜不充分 | 膜没有完全均匀湿透 | 使用100% methanol浸透膜 |
| 靶蛋白分子量小于10,000 | 选择小孔径的膜，缩短转移时间 | |
| 靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值 | 可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液 | |
| 甲醇浓度过高 | 过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替 | |
| 转移时间不够Thick gel | 对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间 | |
| 背景高 | 膜没有完全均匀湿透 | 使用100% methanol浸透膜 |
| 洗膜不充分 | 增加洗液体积和洗涤次数 | |
| 阻断不充分 | 增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等） | |
| 二抗浓度过高 | 降低二抗浓度 | |
| 检测过程中膜干燥 | 保证充分的反应液，避免出现干膜现象 | |
| 曝光过度 | 缩短曝光时间 | |
| 抗体与阻断蛋白有交叉反应 | 检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应 | |
| 没有阳性条带 | 抗体染色不充分 | 增加抗体浓度，延长孵育时间 |
| 酶失活 | 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物 | |
| 标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 | 设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。 | |
| 试剂不匹配 | 一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性 | |
| 一抗失效 | 选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液 | |
| HRP抑制剂 | 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 | |
| 有阳性条带，但条带比较弱 | 抗体染色不充分 | 增加抗体浓度，延长孵育时间 |
| 酶活性降低 | 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物 | |
| 标本中靶蛋白含量太低 | 增加标本上样量。 | |
| 洗膜过度 | 缩短洗涤时间 | |
| HRP抑制剂 | 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 | |
| 抗体活性降低 | 选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置 | |
| 蛋白转移不充分 | 见上述 | |
| 封闭过度 | 减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型 | |
| 曝光时间过短 | 延长曝光时间 | |
| HRP抑制剂 | 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 | |
| 条带位置（大小）不对；或有非特异性条带 | 二抗的非特异性结合 | 增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的） |
| 一抗的特异性不够 | 使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性 | |
| 蛋白降解 | 使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂 | |
| 二聚体或多聚体存在 | 增加蛋白质变性过程及强度 | |
| 抗体浓度过高 | 降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带 | |
| 蛋白上样量过大 | 降低上样量 | |
| 背景有斑点 | 封闭剂中有聚集体 | 使用前过滤封闭试剂 |
| HRP耦联二抗中有聚集体 | 过滤二抗试剂，去除聚集体 | |
| 膜上出现反像（暗背景上白色带） | HRP含量过高 | 降低酶联二抗的浓度 |
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