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师兄师姐再也不用担心我的实验之CHIP篇

师兄师姐再也不用担心我的实验之CHIP篇 巴傲得体外诊断
2016-03-24
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转自核酸科技

ChIP的一般流程:甲醛处理细胞---裂解细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入Protein A和Protein G,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集的DNA-片断---qPCR或者高通量测序分析。



经验分享:

 1.交联固定

甲醛交联的作用是固定蛋白质与基因组DNA之间的相互作用。蛋白质和基因组DNA之间的相互作用有强有弱,有瞬时的相互作用也有长时间稳定的相互作用,因此针对蛋白质与基因组DNA之间相互作用较强的,可以缩短交联时间或者不交联(native ChIP);而针对较弱的相互作用,则需要通过延长交联时间固定两者之间的瞬时相互作用。然而交联时间的长短对后续的超声有负面的影响,交联时间越长,后续片段超声打断越难。所以针对不同的实验,可以较宽范围的调节交联时间,一般控制在5到30分钟之间,一般以交联10分钟为主。

1.1悬浮细胞交联

悬浮细胞交联,即细胞处于悬浮状态,交联时将消化的单个细胞悬浮在交联缓冲液中,加入终浓度为1%的甲醛交联细胞10分钟,室温条件下在摇床中摇动使细胞充分交联。随后加入终浓度为0.125M的甘氨酸终止交联,一般室温条件下反应5分钟即可。终止交联后用预冷的PBS清洗细胞两遍,吸去废液,将交联的细胞干冰或液氮速冻并置于-80℃,用于后续的实验。

1.2 贴壁细胞交联

   贴壁细胞交联时要求贴壁的细胞密度不能太密,一般在80%左右即可。在培养皿中加入适量的交联缓冲液,加入终浓度为1%的甲醛室温条件下交联,交联后用终浓度为0.125M的甘氨酸终止交联。用预冷的PBS洗去废液后,用细胞刮将细胞从培养皿中刮下来,保存于EP管中,干冰或液氮速冻,并置于-80℃,用于后续的实验。

 

1.3 组织细胞的交联

   组织细胞的交联相对步骤要多一些,当组织细胞有血液时,用PBS清洗,除去血液。将组织浸在PBS中,用刀将组织快速的切成小块,小块的体积不大于0.5立方厘米。然后加入至少5倍体积的加入终浓度为1%的甲醛在室温条件下交联20分钟。随后用终浓度为0.125M甘氨酸终止交联。如果不接着往下做,终止交联后用预冷的PBS清洗细胞两遍,吸去废液,将交联的细胞干冰或液氮速冻并置于-80℃,用于后续的实验。接着往下做则需将组织在预冷的PBS中捣碎。捣碎时首先用松的杵接着用紧的杵捣碎组织。这个过程不需要加入蛋白酶抑制剂。捣碎组织后用100微米的细胞过滤器过滤到50毫升离心管中,用40毫升预冷的PBS清洗两遍后,将组织冻存,以备后续超声实验。

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巴傲得体外诊断
巴傲得生物是一家专业的体外诊断厂商,成立于2007年。我们的主要业务是开发和销售各种体外诊断原料和试剂,我们的产品线涵盖了从蛋白/单抗到POCT等多个领域。我们的愿景是为全世界的用户提供更加便捷、快速、准确的诊断解决方案。
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