

福利:关注公众微信号,回复“文献检索”,即可获得NoteExpress软件及教程,回复“基金”即可获得基金申请宝典,回复“资源”即可获得大量科研工具资源获得方法,回复“谷歌”即可获得不翻墙上谷歌方法,回复“通路图”即可获得全套通路图,回复“表观密码”即可获得表观遗传学【David Allis-Epigenetics-2015-2nd Edition】 |
转自核酸科技
ChIP的一般流程:甲醛处理细胞---裂解细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入Protein A和Protein G,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集的DNA-片断---qPCR或者高通量测序分析。

经验分享:
1.交联固定
甲醛交联的作用是固定蛋白质与基因组DNA之间的相互作用。蛋白质和基因组DNA之间的相互作用有强有弱,有瞬时的相互作用也有长时间稳定的相互作用,因此针对蛋白质与基因组DNA之间相互作用较强的,可以缩短交联时间或者不交联(native ChIP);而针对较弱的相互作用,则需要通过延长交联时间固定两者之间的瞬时相互作用。然而交联时间的长短对后续的超声有负面的影响,交联时间越长,后续片段超声打断越难。所以针对不同的实验,可以较宽范围的调节交联时间,一般控制在5到30分钟之间,一般以交联10分钟为主。
1.1悬浮细胞交联
悬浮细胞交联,即细胞处于悬浮状态,交联时将消化的单个细胞悬浮在交联缓冲液中,加入终浓度为1%的甲醛交联细胞10分钟,室温条件下在摇床中摇动使细胞充分交联。随后加入终浓度为0.125M的甘氨酸终止交联,一般室温条件下反应5分钟即可。终止交联后用预冷的PBS清洗细胞两遍,吸去废液,将交联的细胞干冰或液氮速冻并置于-80℃,用于后续的实验。
1.2 贴壁细胞交联
贴壁细胞交联时要求贴壁的细胞密度不能太密,一般在80%左右即可。在培养皿中加入适量的交联缓冲液,加入终浓度为1%的甲醛室温条件下交联,交联后用终浓度为0.125M的甘氨酸终止交联。用预冷的PBS洗去废液后,用细胞刮将细胞从培养皿中刮下来,保存于EP管中,干冰或液氮速冻,并置于-80℃,用于后续的实验。
1.3 组织细胞的交联
组织细胞的交联相对步骤要多一些,当组织细胞有血液时,用PBS清洗,除去血液。将组织浸在PBS中,用刀将组织快速的切成小块,小块的体积不大于0.5立方厘米。然后加入至少5倍体积的加入终浓度为1%的甲醛在室温条件下交联20分钟。随后用终浓度为0.125M甘氨酸终止交联。如果不接着往下做,终止交联后用预冷的PBS清洗细胞两遍,吸去废液,将交联的细胞干冰或液氮速冻并置于-80℃,用于后续的实验。接着往下做则需将组织在预冷的PBS中捣碎。捣碎时首先用松的杵接着用紧的杵捣碎组织。这个过程不需要加入蛋白酶抑制剂。捣碎组织后用100微米的细胞过滤器过滤到50毫升离心管中,用40毫升预冷的PBS清洗两遍后,将组织冻存,以备后续超声实验。
同类文章阅读,直接点击相应标题即可

Bio+平台的宗旨是导师与硕博的服务者,用户与商家的联结者,科研到产业的推动者。我们免费为导师和硕博提供微信在线实名制交流群。行业大牛与初生牛犊都可能是您的群友。
硕博技术专题群包涵WB,IHC,动物技术,SCI写作,分子克隆,自然基金申请,IP与蛋白相互作用,生物软件与生物信息学,non-codeRNA研究,细胞株交换与细胞培养,ppl质粒交换,CRISPR-Cas9研究,蛋白表达纯化技术,信号通路研究,表观遗传学,转化医学-细胞治疗研究,流式细胞技术,meta分析,自噬研究等,
最近又新建了组学分析交流群,SCI插图制作交流群,考研调剂交流群等
更有肠道微生物交流群,科研抗体讨论群期待您的加入
感兴趣的请关注本公众号后回复“硕博群”即可获知加入方法
。
导师群交流群(目前仅允许导师加入)包涵分子与生化导师研讨群,细胞生物学导师研讨群,免疫学导师研讨群,神经生物导师研讨群,微生物与寄生虫导师研讨群,药学相关导师研讨群,肿瘤研究导师研讨群,干细胞与组织再生导师研讨群,病理生理导师研讨群,心血管研究导师研讨群,呼吸系统导师研讨群,消化系统导师研讨群,内分泌/代谢系统导师研讨群,泌尿生殖系统导师研讨群,昆虫科学导师研讨群,老年病学(抗衰老)导师研讨群,食品安全相关导师研讨群,导师课题/项目申请经验交流群,功能基因组学与蛋白组学导师研讨群。
最近又新建了同城导师聚会群等,更多专业学科导师群等待您的加入
需要加入的导师,请关注本公众号后回复“导师群”即可获知加入方法

