IF=41.44|去甲基化酶ALKBH5通过PKMYT1 m6A修饰抑制胃癌侵袭

胃癌(GC)是第五大常见癌症类型，在世界癌症相关死亡原因中排名第三。GC细胞的转移能力是导致死亡的重要原因。目前GC患者的治疗主要依靠手术、化疗、生物治疗等，但这些方法仍不能令患者和医生满意。GC的浸润和转移是当前临床治疗中一直存在的难题。最近的文献研究表明，GC的表观遗传变化与其侵袭和转移能力密切相关。因此，深入了解胃癌细胞转移过程中的表观遗传修饰，对临床治疗有很大帮助。RNA修饰是表观遗传调控的一种形式，已被发现广泛存在于转录组水平。N6-甲基腺苷(m6A)作为最常见的真核mRNA修饰形式，已被发现其参与多种生物过程。M6A是由m6A WER（“写入器”、“擦除器”和“读取器”）调节的可逆动态RNA修饰。mRNA的命运随着mRNA不同区域中m6A修饰的变化发生不同地改变。

最近报道了m6A在多种癌症中的作用。研究表明，被改变了的m6A修饰广泛参与了包括GC在内的各种肿瘤的进展过程。作为一种重要的表观转录组调节剂，据报道甲基转移酶3(METTL3)通过调节GC中的HDGF m6A修饰来促进肿瘤血管生成和糖酵解。锌指MYM型因子1(ZMYM1)也被认为是METTL3的m6A靶标，可通过募集复合物介导E-钙粘蛋白的表达来促进转移。SPHK2和MYC也受METTL3调节以加强迁移和入侵。作为一个动态调控系统，m6A修饰的整体水平受其“写入者”和“擦除者”的共同调控。这些研究大多从甲基转移酶的角度考察GC细胞侵袭和转移的机制，但对脱甲基酶的参与知之甚少。去甲基化酶参与胃癌细胞侵袭转移的具体分子机制尚未完全阐明。

在这项研究中，作者确定了alkB同系物5(ALKBH5)（一种关键的去甲基化酶）对GC细胞转移能力的抑制作用。作者进一步筛选了关键的下游分子和修饰位点，揭示了ALKBH5调节GC细胞侵袭的潜在机制。

为了评估GC中m6A修饰的总体水平，随机选择了5对具有相邻正常样本的临床肿瘤组织。使用EpiQuik m6A RNA甲基化定量试剂盒，作者观察到GC组织中的m6A水平明显高于邻近的正常组织（图1A），表明m6A可能参与了GC的发生或进展。选择成对的组织用于进一步的甲基化RNA免疫沉淀测序(MeRIP seq)。m6A抗体富集的RNA序列通过高通量测序直接测序，使用MACS2软件进行峰调用和峰分布（阈值q值=0.05）。与之前的报道一致，在三对组织的MeRIP-seq分析中，m6A信号主要出现在终止密码子和mRNA转录本的3’UTR附近（图1B）。HOMER软件用于识别m6A峰结合的mRNA区域上的基序（表示m6A位点的序列保守性）。M6A修饰集中在GGACU基序上（图1C）。大多数基因在肿瘤组织中表现出更高水平的m6A修饰和mRNA表达（图1D，S1A-B）。GO分析表明，这些基因主要富集在细胞间粘附和上皮细胞迁移中（图1E）。KEGG分析还显示紧密连接和内体膜富集（图S1C）。全局基因集富集分析(GSEA)分析显示磷脂酰肌醇信号系统和RNA聚合酶明显富集（图S1D-F）。正如数据分析所确定的，大多数在肿瘤组织中表现出高m6A水平的基因也表现出显著高于邻近正常组织的mRNA水平（图1F）。

图1

补充图1

m6A水平主要由甲基转移酶(METTL3、METTL14和WTAP)和去甲基化酶(FTO和ALKBH5)平衡，而据报道甲基转移酶METTL3和METTL14可调节GC进展。然而，GC中去甲基化的机制报道较少。为了探索参与细胞迁移的关键去甲基化酶，利用TCGA数据库探索了m6A相关酶与迁移相关基因之间的相关性。数据显示ALKBH5与这些基因呈显著负相关，而FTO主要与它们呈正相关（图1G）。检测49例患者胃癌组织和正常组织的mRNA水平表明，ALKBH5在胃癌组织中表达水平较低，而胃癌与正常组织之间的FTO表达不如ALKBH5显着（图1H，S1G）。邻近正常组织中的ALKBH5蛋白水平也高于GC组织中的水平（图S1I）。因此，作者关注ALKBH5的表达及其在GC转移中的可能机制。TCGA和GEO数据库都显示GC中ALKBH5表达减少（图1I-J）。来自组织微阵列的统计分析还显示，ALKBH5的蛋白质水平在邻近的正常组织中显着更高（图1K-L）。接受者操作特征(ROC)曲线表明ALKBH5对GC的临床诊断高度敏感和特异（图1M）。生存分析还表明，ALKBH5高表达的患者预后改善（图1N）。临床统计显示，ALKBH5在有远处转移的患者中的表达低于无远处转移的患者（图1O）。在淋巴结转移组中观察到类似的结果（图1P）。临床特征还显示ALKBH5与肿瘤分期和病理淋巴结密切相关（图S1H、J）。综上所述，提示ALKBH5的低表达可能是胃癌转移的根源。

为了挖掘ALKBH5在GC进展中的潜在特征，作者首先评估了ALKBH5在GC细胞系中的表达（图S2A-B）。之后，在HGC-27和BGC-823细胞中建立了ALKBH5的稳定过表达（图2A-B和S2C-D）。作者还在SGC-7901细胞中沉默了ALKBH5（图2C-D）。通过transwell实验验证，GC细胞的转移能力在ALKBH5过表达后明显受到抑制（图2E，G和S2E-H），而在SGC-7901细胞中通过ALKBH5敲低大大增强了转移能力（图2F，H）。正如预期的那样，划痕试验发现ALKBH5的上调显著抑制了GC细胞的迁移能力（图2I，S2I-J）。ALKBH5表达的减弱加速了GC细胞的迁移（图2J）。

据报道，ALKBH5 H204A会使氨基酸204发生突变，可能会导致ALKBH5去甲基化酶活性不足。为了阐明m6A在迁移中的作用，作者在HGC-27细胞中使用了ALKBH5 H204A突变体（图2K）。结果表明，ALKBH5突变对其mRNA或蛋白水平的影响较小（图2M-N），但ALKBH5 H204A细胞中的m6A水平明显高于LV-ALKBH5 GC细胞（图2L）。与ALKBH5过表达相比，突变体组的迁移和侵袭能力也得到增强（图2O-P）。另外，野生型或ALKBH5 H204A在ALKBH5敲低GC细胞中过表达（图S2K，N）。Transwell实验显示野生型ALKBH5过表达后迁移和侵袭能力降低，而H204A没有这种抑制作用（图S2K-P）。这些数据表明，ALKBH5过表达对细胞侵袭的抑制主要取决于其去甲基化酶活性。

图2

补充图2

为了探索ALKBH5在GC转移中的潜在靶标，在对照和ALKBH5过表达BGC-823细胞进行了RNA-seq（图S3A）。RNA-seq结果表明，大多数转录物响应于ALKBH5过表达而下调（图S3A）。KEGG和GSEA分析均表明，mRNA水平下调的基因在粘着斑、缝隙连接和紧密连接中高度富集（图S3B-D）。这些结果暗示ALKBH5的暴露可以调节许多与侵袭和转移相关的基因的水平，表明ALKBH5对胃癌的侵袭和转移至关重要。

为了确定在ALKBH5下游发挥关键作用的主要靶基因，根据MeRIP-seq结果选择了816个基因，其m6A水平在GC中明显高于邻近组织。结合RNA-seq结果中ALKBH5过表达后显著改变的3715个基因，作者获得了237个共同基因。为了进一步确定GC中必需的下游靶基因，作者使用GEPIA数据库识别了2596个在GC中具有显著高表达（log2 FC > 1.2）的基因，最终获得了36个基因。通过文献综述筛选了已在GC中报道的四种基因（PKMYT1、NT5E、PXDN和MYH9）（图3A）。使用MeRIP-qRT-PCR和mRNA水平验证，作者发现当ALKBH5过表达或破坏时，只有PKMYT1表现出稳定的改变（图3B-F，S3E）。在ALKBH5干扰SGC-7901细胞后，PKMYT1的m6A水平稳定增加（图3B）。PKMYT1的表达在ALKBH5过表达后显著降低（图3C-D），在ALKBH5干扰后增加（图3E-F）。其他三个基因在过表达或干扰ALKBH5后显示mRNA水平的不同变化（图S3F-G）。RIP和RNA pulldown测定均证明了ALKBH5和PKMYT1转录本之间的结合（图3G-H）。因此，作者初步怀疑PKMYT1可能是ALKBH5的下游靶标。

组织微阵列和TCGA数据库结果均表明PKMYT1在GC中高表达，其表达与不良预后密切相关（图3I-M）。ROC分析表明PKMYT1对临床GC诊断有显著区分（图3N）。组织微阵列表达统计显示ALKBH5和PKMYT1表达之间显著负相关（图3O）。为了验证PKMYT1在GC转移中的独特作用，作者首先在GC细胞系中进行了PKMYT1破坏和过表达。Transwell实验表明，PKMYT1过表达后GC细胞的转移能力明显增强（图S3H-J）。当PKMYT1被抑制时，GC细胞的转移行为被显著抑制（图S3K-M）。为观察ALKBH5/PKMYT1对胃癌转移的影响，进行了拯救实验。结果表明，PKMYT1的过表达显著恢复了由ALKBH5过表达引起的转移能力（图3P-R），当破坏PKMYT1抑制由ALKBH5干扰引起的转移能力时观察到类似的结果（图3S-U，S3N-O）。这些结果表明PKMYT1作为ALKBH5的下游发挥作用。

图3

补充图3

为了鉴定ALKBH5影响的特定m6A位点，使用SRAMP网站（http://www.cuilab.cn/sramp/）预测了

PKMYT1的mRNA序列。预测结果展示了五个潜在的m6A修饰位点，在PKMYT1的mRNA序列中具有非常高的置信度（图4A）。为这五个位点设计了十个特异性引物。MeRIP-qRT-PCR表明对应于前两个位点的片段的m6A水平响应于ALKBH5过表达而显著降低（图4B）。当突变涉及ALKBH5脱甲基酶活性的残基时，它们的m6A水平得到恢复（图4B）。在ALKBH5敲低后观察到相反的结果（图S4A）。作者的数据表明PKMYT1 mRNA上的两个位点可能是ALKBH5调控的特定位置。在MeRIP-seq中还检查了GC组织中这两个位点的m6A水平。来自IGV基因组浏览器的结果表明，与正常组织相比，GC中两个位点的m6A修饰水平明显更高（图4C）。此外，PKMYT1在ALKBH5 H204A组中明显下调（图S4B-C）。这两个位点的突变旨在观察m6A修饰对PKMYT1的影响（图4D）。结果显示突变组中PKMYT1的整体水平降低（图4E-F）。同时进行transwell实验。结果表明，这两个位点的突变导致GC转移能力显著降低（图S4D-F）。这种现象在ALKBH5敲低后更为明显（图4G-H，S4G-K）。因此，PKMYT1以m6A依赖性方式促进GC的侵袭和迁移。

图4

补充图4

众所周知，m6A修饰主要依赖于“阅读器”蛋白发挥额外功能。为了进一步研究PKMYT1的m6A修饰中潜在的“阅读器”蛋白，进行了RNA pulldown实验和质谱分析。质谱结果显示，IGF2BP3和RBMX可能在PKMYT1 m6A修饰后发挥作用，而IGF2BP3的得分（得分=69.33）远高于RBMX的得分（得分=29.05）（图5A）。作者选择IGF2BP3进行验证。RNA pulldown和RIP测定均表明IGF2BP3可以与PKMYT1 mRNA结合（图5B-C和S5A-D）。组织微阵列和TCGA数据库均显示GC中IGF2BP3高表达，其高表达表明GC患者预后不良（图5D-G）。组织微阵列和TCGA数据库结果均显示GC中IGF2BP3和PKMYT1表达之间存在显著正相关（图5H-I）。细胞系中的验证实验证实，在干扰IGF2BP3后，PKMYT1的表达显著降低（图5J-K）。

据报道，IGF2BP3是一种m6A阅读器蛋白，主要通过增强mRNA稳定性发挥作用。因此，评估了干扰和过表达ALKBH5后PKMYT1 mRNA的稳定性。发现PKMYT1的mRNA稳定性在放线菌素D处理下过表达ALKBH5后显著降低，但在干扰ALKBH5后明显增加（图5L-M）。在ALKBH5 H204A组中，PKMYT1 mRNA的稳定性得到恢复（图5N）。在干扰读取蛋白IGF2BP3后，观察到PKMYT1的mRNA稳定性显著降低（图5O）。为了研究m6A位点修饰对PKMYT1 mRNA稳定性的影响，在放线菌素D处理下，用PKMYT1-CDS、mut1和mut2质粒转染GC细胞。观察到这两个位点突变后PKMYT1的mRNA稳定性也降低（图5P）。

图5

补充图5

图6