G3BP1-Family-USP10去泛素化酶：核糖体40S亚基降解的“阻碍者”

基因密码子的准确阅读对于产生功能性蛋白质至关重要。因此，检测mRNA在转录和成熟后的错误，以及排除由突变基因编码的转录本是至关重要的过程。mRNA的监测过程，包括对异常mRNA或翻译缺陷核糖体的感知、停滞核糖体的分解以及异常mRNA和新生多肽的翻转，是活跃的研究领域，对人类罕见遗传病新疗法的发现具有重要意义。已知的mRNA质检机制包括No-go降解（No-go decay, NGD），Nonstop降解（Nonstop decay, NSD）和无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）。尽管对核糖体相关质量控制（RQC）和60S亚基循环的研究取得了卓越进展，但尚未研究过停滞核糖体40S亚基的命运。应激颗粒（SGs）包括多聚腺苷酸mRNA、核糖体40S亚基和各种翻译起始因子。应激颗粒的一个核心组分是G3BP蛋白，由二聚化结构域NTF2、两个无序区（IDR1/2）及RNA结合域（RRM/RGG）构成。虽然G3BP1家族RNA结合蛋白（RBPs）在SGs中很容易检测到，但它们在细胞RNA代谢中的功能仍有待研究。

基于以上背景，作者探究了G3BP1对停滞核糖体40S亚基的影响。

为了研究G3BP1-family-USP10复合物的细胞功能，作者首先通过免疫沉淀(IPs)、质谱分析、免疫印迹（IB）实验证实了它们之间的稳定相互作用（图1B）。光活化核糖核苷增强的交联和免疫沉淀（PAR-CLIP）实验结果表明过表达FH-G3BP1或FH-G3BP2的细胞在作者预测的分子量处产生了单个放射标记的RNA蛋白交联带（图1C）。FH-USP10蛋白产生了两个不同的放射标记带（图1D），一个在 120 kDa 处对应于 FH-USP10，另一个在 70 kDa处被鉴定为G3BP1。G3BP1家族的RBP都优先与成熟mRNA交联，尤其是蛋白质编码区（CDS），在较小程度上也与5’ 和3’ 非翻译区UTRs交联（图1E和1F）。PAR-CLIP实验结果显示FH-USP10和G3BP1的交联读数具有很好的相关性（Pearson r = 0.85），主要映射区域是成熟mRNA的编码序列（CDS）（图1H-J）。最后，作者检测到USP10和G3BP1家族RBPs与18S rRNA的交联，但未检测到与28S rRNA的交联（图1G）。与H26的交联显示出USP10和G3BP1蛋白的不同但重叠的T-C转换模式（图1K），表明 rRNA表面和USP10-G3BP1家族的N端异二聚化结构域的空间接近性，而不是直接与高亲和力rRNA结合。

图1  G3BP1-Family-USP10复合物与mRNA CDS和18S rRNA交联

多核糖体图谱和亲本细胞裂解物免疫沉淀实验结果显示G3BP1、G3BP2和USP10蛋白存在于多核糖体中，但也有更小的游离核糖体碎片（图2A）。同时敲低G3BP1和G3BP2的细胞可以存活，但增殖率显著降低，并伴有翻译阻滞的迹象，多核糖体减少为单体，同时伴随着60S游离亚基的积累（图2B）。在USP10敲低的细胞中，增殖率略有降低，并且观察到60S亚基的积累更为明显（图2C）。Dox诱导FH-USP10的表达逆转了上述现象，而非活化突变体FH-C424A- USP10的表达未改变这一表型（图2D-2F）。

图2  G3BP1-Family-USP10复合体调节多核糖体图谱

为了鉴定G3BP1-Family-USP10复合体的蛋白靶点，作者进行了泛素蛋白质组学分析，如图在USP10敲低细胞中富集到了泛素化程度最高的RPS2、RPS3和RPS10（图3A），并且进一步通过免疫印迹实验验证组学结果，FH-USP10的表达逆转了RPS2、RPS3和RPS10的单泛素化（图3B-C）。G3BP1/2敲低也引起单泛素化RNA结合蛋白（RPs）的积累，UPS10免疫印迹结果表明在G3BP1/2双敲低作用下，USP10蛋白水平显著降低，表明USP10异二聚体具有稳定G3BP1蛋白的功能（图3C）。与亲本细胞相比，单泛素化的RPs在USP10敲低细胞的核糖体40S、80S亚基和多核糖体内显著富集（图3D）。

图3  G3BP1-Family-USP10复合体去泛素化40S 亚基的RNA结合蛋白

与亲本细胞相比，作者观察到USP10敲低和G3BP1/2敲低细胞中40S和60S RPs与其他蛋白相比显著减少（图4A）。与亲本细胞相比，USP10敲低细胞中18S/28S rRNA比值显著降低（图4B）。为了探究40S亚基降解的原因，作者过表达C端有myc标记的野生型、K214R、K227R、K230R或K227R/K230R突变型RPS3，免疫印迹试验结果表明K214R-RPS3的表达可消除RSP2的泛素化（图4C）。同时，K214R-RPS3的表达可阻断RPS3的泛素化，而不是K227R或K230R，挽救核糖体亚基不平衡的USP10敲低以及G3BP1/2敲低细胞（图4D）。有趣的是，在Torin1缺失的情况下，RPS3-Keima，而不是K214R-RPS3-Keima，使USP10敲低细胞自噬通量增加（图4E），表明RPS3在K214位点的泛素化对溶酶体降解至关重要。

图4  G3BP1-Family-USP10复合体去泛素化40S RPs抑制40S翻转

为了评估G3BP1-Family-USP10复合体在感知异常mRNA方面的潜在作用，作者构建了稳定表达GFP绿色荧光和mCherry红色荧光报告融合蛋白的细胞系，融合蛋白由12个赖氨酸（AAA）密码子组成的间隔区分离，可诱导核糖体翻译停顿，或者6个苏氨酸-丝氨酸（ACTAGC）密码子作为对照通过流式细胞术检测荧光信号。在ZNF598-KO细胞中融合蛋白的表达不受间隔序列的影响，因为这些细胞不能感知异常的mRNA（图5A）。相反，在亲本细胞中过表达c末端具有myc标记的野生型，K214R, K227R, K230R，或K227R/K230R突变型RPS3蛋白，报告蛋白的表达没有改变，碰撞感知及核糖体相关质量控制不受RPS3单泛素化影响（图5A）。随后作者证实在亲本细胞中，低剂量的茴芹霉素处理比高剂量处理诱导更强的RPS10单泛素化（图5B）。在USP10-KO细胞中，敲除ZNF598抑制了RPS10的单泛素化，但仍残留一些PS2和RPS3单泛素化，对茴香霉素处理不敏感（图5B）。 同样，USP10敲低细胞中过表达myc标记的K138R-RPS10也降低了RPS2和RPS3单泛素化水平（图5C）。与亲本细胞相比，PELO敲低细胞表现出强烈的80S核糖体积累，也显示单泛素化RPS3的富集（图5D）。USP10敲低和USP10-PELO敲低的细胞RPS3泛素化水平更高（图5E）。在敲低ZNF598和PELO的情况下，G3BP1的RNA交联强度显著降低（图5F）。

图5  OMMD10通过降低HCC细胞内铜水平促进铁死亡来抑制HIF1a的稳定性